胃癌中miR-216a表达的变化及其对胃癌细胞侵袭的靶向调控作用

苟兰琼，何平，郑连喜，陈宗万，屈敏，杨科，弓达秀

(1.攀钢集团总医院肿瘤科，四川 攀枝花 617023；2.唐山市人民医院，河北 唐山 063001)

胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，发病率高、治愈率低、整体预后较差[1-2]。肿瘤的远处转移是影响胃癌病情转归的重要因素，而癌细胞的侵袭是造成肿瘤转移的重要病理环节，但目前胃癌细胞调控的机制并未完全阐明。微小RNA(miRs)是一类在转录后水平调节基因表达的小分子非编码RNA，通过改变靶基因的表达来产生相应的生物学效应。近年来，多种miRs被证实参与抑癌基因、原癌基因表达的调控并且与多种恶性肿瘤的发生发展有关。miR-216a是一种具有抑癌活性的miRs，在肺癌、结直肠癌、宫颈癌等恶性肿瘤病灶内均被证实呈低表达趋势[3-5]。本实验通过对胃癌中miR-216a表达的变化及其对胃癌细胞侵袭的靶向调控作用的研究，探寻其在胃癌发生发展中所起的作用及潜在作用机制。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 病例资料 胃癌组织和癌旁组织取自2015年3月至2018年10月唐山市人民医院接受手术切除的38例胃癌患者。其中，男性23例，女性15例；年龄42～65岁，平均年龄(51.38±9.82)岁；患者术前均未接受过放化疗且经术后病理证实为胃癌。患者签署知情同意书，并报院伦理委员会批准。

1.1.2 实验材料 SGC7901细胞株购自中科院上海细胞资源中心，miR-216a模拟物及对应的阴性对照(NC)模拟物购自上海吉凯公司，miR-216a表达检测试剂盒购自北京天根公司，Transwell小室购自Corning公司，Matrigel胶购自B&D公司，结晶紫购自上海碧云天公司，MMP2、MMP9、N-cadherin、p-JAK2、p-STAT3的第一抗体购自Abcam公司。超纯RNA提取试剂盒、SuperRT cDNA第一链合成试剂盒、UltraSYBR Mixture(Low ROX)试剂盒购自北京康为世纪公司。

1.2 方法

1.2.1 miR-216a的检测 取胃癌组织和癌旁组织，采用miRNA提取试剂盒提取组织中的miRNA后采用miRNAcDNA第一链合成试剂盒将miRNA合成为对应的cDNA，采用miRNA荧光定量PCR检测试剂盒对cDNA中的miR-216a进行扩增，根据扩增曲线计算miR-216a的表达量。

1.2.2 细胞培养及转染 SGC7901用含有100 mL/L胎牛血清的DMEM在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的环境中培养，细胞汇合至90%后常规用胰蛋白酶消化传代，传代后的细胞接种在培养板内并进行转染。NC组转染NC的模拟物、miR-216a组转染miR-216a的模拟物。

1.2.3 细胞侵袭的检测 胰蛋白酶消化后的SGC7901细胞调节至2×105/mL，取0.2 mL接种在Transwell小室的上室内，下室内加入含有100 mL/L胎牛血清的DMEM 0.8 mL，转染不同模拟物后24 h、48 h，用棉签擦去半透膜上未发生穿膜的细胞，取下半透膜并用4%多聚甲醛固定30 min，而后用0.1%结晶紫染色20 min，在显微镜下观察并对穿膜细胞进行计数。

1.2.4 基因蛋白表达的检测 SGC7901细胞接种在6孔培养板内，转染不同模拟物后48 h，弃去培养基、保留细胞，加入蛋白裂解液后提取细胞内的蛋白样本，而后将蛋白样本加入聚丙烯酰胺凝胶中，依次完成电泳、电转膜、5%脱脂牛奶室温封闭2 h、1:1 000第一抗体4 ℃孵育过夜、1:1 000第二抗体室温孵育2 h，最后曝光得到蛋白条带，根据条带的灰度值计算蛋白表达量。

1.2.5 基因mRNA表达的检测 SGC7901细胞接种在6孔培养板内，转染不同模拟物后48 h，弃去培养基、保留细胞，采用超纯RNA提取试剂盒提取细胞中的RNA，采用SuperRT cDNA第一链合成试剂盒将RNA反转录为cDNA，最后使用UltraSYBR Mixture(Low ROX)试剂盒配置PCR反应体系，对cDNA中的MMP2、MMP9、N-cadherin、JAK2、STAT3进行扩增，根据扩增曲线计算mRNA表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 miR-216a在胃癌组织和癌旁组织中的表达

荧光定量PCR检测证实，胃癌组织和癌旁组织中miR-216a的表达量分别为(0.41±0.09)和(0.83±0.14)，胃癌组织中miR-216a的表达量明显低于癌旁组织，差异有统计学意义(t=5.643、P=0.001)。见图1。

2.2 不同病理特征胃癌组织中miR-216a表达的比较

TNM分期III期胃癌中miR-216a的表达量明显低于TNM分期I-II期胃癌，低未分化胃癌中miR-216a的表达量明显低于中高分化胃癌，有淋巴结转移的胃癌中miR-216a的表达量明显低于无淋巴结转移的胃癌，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.3 miR-216a对SGC7901细胞侵袭的影响

Transwell模型检测SGC7901细胞穿膜数证实，转染后24 h、48 h，miR-216a组SGC7901细胞的穿膜数明显少于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2和表2。Western blot检测证实，转染后48 h，miR-216a组SGC7901细胞中MMP2、MMP9、N-cadherin的表达量均明显低于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3、表3和表4。

病理特征例数miR-216at值P值TNM分期 I-II220.56±0.119.2120.001 III160.28±0.06分化程度 中高分化200.64±0.1312.8630.001 低未分化180.22±0.05淋巴结转移 否230.60±0.1210.9730.001 是150.24±0.05

表2 两组间SGC7901细胞穿膜数的比较

组别24 h48 hNC组(n=5)89.31±12.41125.48±20.19MiR-216a组(n=5)62.75±9.2988.58±12.58t值3.8313.469P值0.0050.008

组别MMP2MMP9N-cadherinNC组(n=5)1.08±0.180.98±0.130.91±0.15MiR-216a组(n=5)0.41±0.070.62±0.090.68±0.08t值7.7575.0913.025P值0.0010.0010.016

组别MMP2MMP9N-cadherinNC组(n=5)0.92±0.150.97±0.171.03±0.17MiR-216a组(n=5)0.55±0.070.61±0.080.67±0.09t值11.7524.2854.185P值0.0000.0030.003

2.4 miR-216a对SGC7901细胞中JAK2/STAT3通路的影响

Western blot检测证实，转染后48 h，miR-216a组SGC7901细胞中p-JAK2、p-STAT3的表达量均明显低于NC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、表5和表6。

组别p-JAK2p-STAT3NC组(n=5)0.89±0.130.97±0.15MiR-216a组(n=5)0.68±0.100.44±0.07t值 2.8637.160P值0.0210.001

组别JAK2STAT3NC组(n=5)0.91±0.181.03±0.21MiR-216a组(n=5)0.55±0.070.65±0.08t值 4.1683.781P值0.0030.005

3 讨论

胃癌细胞侵袭所造成的病灶远处转移是导致晚期胃癌患者生存率较低的重要因素，探明胃癌细胞侵袭的调控机制有助于为靶向治疗手段的研发提供依据。miRs在恶性肿瘤增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为的调控中起到重要作用，与靶基因mRNA的3’非翻译区结合后能够抑制mRNA向蛋白质的翻译过程，进而在转录后水平实现对基因表达的调控并通过不同基因表达的变化来产生不同的生物学效应。在诸多与恶性肿瘤相关的miRs中，miR-216a是一类具有抑癌活性的miRs，在多种恶性肿瘤病灶内均被证实呈低表达趋势[3-5]。

近年来也有细胞实验[6-8]证实，miR-216a能够靶向调控乳腺癌、肾癌、卵巢癌等多种恶性肿瘤细胞的侵袭。本研究结果显示，胃癌组织中miR-216a的表达量明显低于癌旁组织，提示低表达的miR-216a与胃癌的发生有关。结合miR-216a对多种癌细胞侵袭的靶向调控作用推测，胃癌中低表达的miR-216a可能靶向促进癌细胞的侵袭、增加miR-216a的表达则能抑制癌细胞的侵袭。

为了进一步验证上述关于miR-216a在胃癌细胞中生物学效应的推测，miR-216a的模拟物被转染进入胃癌细胞株SGC7901中，通过miR-216a的模拟物来增强miR-216a的生物学功能后检测了细胞的侵袭情况。MMP2、MMP9是MMPs家族的重要成员，在胃癌中的高表达能够促进细胞外基质的水解并使细胞不断向邻近组织侵袭[9-10]；N-cadherin是间质表型标志物，在胃癌中的高表达能够使细胞间黏附性和极性减弱，进而有利于癌细胞向邻近组织运动[11]。本研究结果显示，miR-216a组的穿膜细胞数少于NC组，细胞中侵袭基因MMP2、MMP9、N-cadherin的蛋白表达及mRNA低于NC组，表明miR-216a对胃癌细胞的侵袭具有抑制作用。

胰腺癌中关于MiR-216a调控癌细胞侵袭的实验[12]证实，细胞中直接受到miR-216a靶向调控的基因是JAK2/STAT3信号通路，该信号通路是具有促增殖、促侵袭作用的通路，信号分子以磷酸化的形式发生激活后能够在细胞核内启动MMP2、MMP9、N-cadherin等侵袭基因的表达，进而通过侵袭基因的生物学效应来促进细胞侵袭[13-14]。本研究结果显示，miR-216a组细胞中p-JAK2、p-STAT3的蛋白表达量及JAK2、STAT3的mRNA表达量均明显低于NC组，提示胃癌细胞中JAK2/STAT3信号通路直接受到miR-216a的靶向调控，miR-216a通过抑制JAK2/STAT3信号通路来抑制胃癌细胞的侵袭及细胞中多种侵袭基因的表达。见图5。

综上所述，胃癌中miR-216a的低表达能够靶向促进胃癌细胞的侵袭且该作用与JAK2/STAT3信号通路有关，miR-216靶向调控JAK2/STAT3信号通路的机理如图5所示。本研究能够为深入探究胃癌侵袭的调控机制及相应的靶向治疗药物提供参考依据。