利拉鲁肽极化M2型巨噬细胞改善非酒精性脂肪肝的机制

蒋晓梅，刘翀

（丽水市中心医院 药学部，浙江 丽水 323000）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤[1-2]。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，NAFLD在我国的发病率日益升高，据不完全统计，脂肪肝发病率在2型糖尿病患者中约占50%，且多以NAFLD为主[3]。利拉鲁肽是一种人胰高血糖素样肽-1（human glucagons-like peptide-1，GLP-1）类似物，具有降低血糖、血脂，改善胰岛素抵抗等作用，在临床上被广泛应用于治疗2型糖尿病[4]。研究发现，利拉鲁肽可降低NAFLD大鼠的总胆固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（trilaurin，TG）水平，发挥对肝脏的保护作用[5]。巨噬细胞广泛参与人体的各项免疫活动[6-7]，巨噬细胞被极化后会释放炎症趋化因子和细胞因子，发挥抗感染和修复组织的功能[8]，最近的研究表明，M2型巨噬细胞在治疗2型糖尿病中起到了非常重要的作用[9]。然而目前未见研究报道利拉鲁肽能否通过影响M2巨噬细胞极化发挥治疗2型糖尿病NAFLD的作用。故本研究通过构建NAFLD小鼠模型，探讨利拉鲁肽对改善2型糖尿病伴随的NAFLD的潜在作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及试剂：SPF级健康6～8周龄雄性C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005；利拉鲁肽购自丹麦诺和诺德公司；高糖高脂饲料（10%猪油、10%蔗糖、2%胆固醇、10%蛋黄粉、68%基础饲料）购自南京协同生物有限公司；链脲佐菌素（streptozocin，STZ）购自美国Sigma公司；丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、TG检测试剂盒购自南京建成生物科技有限公司；IL-4和IL-10 ELISA试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.1.2 实验仪器：MK-500C电子天平购自日本YMC公司；Beckman Coulter流式细胞仪购自美国Beckman公司；7070型全自动生化分析仪购自日本Hitachi公司；TS-100光学显微镜购自日本奥林巴斯公司。

1.2 方法

1.2.1 NAFLD模型制备：将小鼠适应性喂养1周后，随机分为2组，分别为正常组（n=15），高糖高脂饲料组（n=40）。正常组普通饲料喂养；高糖高脂饲料组高糖高脂饲料喂养4周，尾静脉注射0.1 mol/L的无菌枸橼酸（35 mg/kg），腹腔注射STZ溶液200 mg/kg，72 h后测定血糖，初测血糖≥16.5 mmol/L，稳定5 d后，进行复测，以16.7 mmol/L≤血糖≤25.0 mmol/L为2型糖尿病NAFLD造模成功。

1.2.2 分组及给药：从造模成功的小鼠中随机选取30只，分为模型组和利拉鲁肽组，每组15只。利拉鲁肽组皮下注射利拉鲁肽（100 μg/kg），每日1次，正常组和模型组注射相同体积的0.9%氯化钠溶液，连续给药4周，隔天测量体质量和肝脏质量（打开腹腔充分暴露肝脏，取新鲜肝脏，迅速称湿重），计算肝脏指数=肝脏重量/体质量×100%。

1.2.3 肝组织HE染色：将肝组织置于4%中性甲醛固定，进行石蜡包埋，常规4 μm切片，将切片烘干后用二甲苯脱蜡，乙醇脱水，HE染色，乙醇脱水，透明，最后用中性树胶封片，在光学显微镜下观察肝组织病变情况。

1.2.4 肝组织油红O染色：将肝组织置于蔗糖中冰冻切片，将切片烘干后用二甲苯脱蜡，用乙醇梯度水化，将切片放入油红O染色液中，最后用甘油明胶进行封片，在光学显微镜下观察肝组织病变情况。

1.2.5 血清指标检测：对小鼠进行心脏取血，3 000 r/min，离心15 min，分离血清，用全自动生化分析仪检测ALT、AST和TG含量。

1.2.6 流式细胞术检测：颈椎脱臼处死小鼠后，在无菌条件下向腹部注入含双抗（100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）的DMEM培养基，抽取腹腔液约4 mL；常温1 000 r/min离心8 min，弃去上清液，用含10% FBS和含双抗的DMEM培养液调整细胞浓度，接种于12孔培养板，37 ℃，5% CO2培养箱培养3 h。弃上清液，将细胞置于含10% FBS和含双抗的DMEM培养液中24 h后，收集上清液及细胞，将细胞用PBS洗后将浓度调至5×105个/管，加1 μL FITC-抗小鼠CD206抗体常温下避光孵育30 min，PBS重悬，用流式细胞仪检测，分析M2型巨噬细胞的比例。

1.2.7 ELISA法检测：取肝组织剪碎，冰浴下研磨制备组织匀浆，离心后吸取上清液，根据ELISA试剂盒的说明书检测IL-4和IL-10的含量。

1.2.8 RT-PCR检测：从冷冻的肝脏标本中分离提取总RNA，反转录合成cDNA。IL-4、IL-10、CD206、CD301、MGL-1、MGL-2和Arg-1等采用RT-PCR实验测定。以β-actin为内参，采用2-ΔΔCt法对定量结果进行分析，获得上述基因mRNA的相对表达量，引物序列如表1所示。

1.3 统计学处理方法 所有数据采用SPSS19.0统计软件进行分析。正态分布计量资料以表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 RT-PCR引物序列表

2 结果

2.1 小鼠体质量及肝脏重量变化情况 模型组小鼠的体质量显著高于正常组，而利拉鲁肽处理后小鼠体质量明显减轻（P＜0.01）。与正常组比，模型组的肝指数显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，利拉鲁肽组小鼠的肝指数显著降低（P＜0.01）。见图1。

2.2 小鼠肝组织病理染色结果 HE染色结果表明，正常组肝细胞排列整齐，细胞中间有大而圆的细胞核，细胞质均匀，无脂肪滴浸润；与正常组比，模型组小鼠肝组织内出现大量大小不等的脂肪空泡，肝细胞排列紊乱，部分可见炎性细胞浸润；与模型组比，利拉鲁肽组肝脏组织病变减轻，肝细胞排列整齐，脂肪滴明显减少。油红O染色结果表明，正常组肝组织中几乎无脂肪滴；与正常组比，模型组脂肪滴增多且在肝组织中分布广泛；与模型组比，利拉鲁肽组的脂肪滴明显减少。见图2。

2.3 小鼠血清中TG、AST、ALT的表达 与正常组比，模型组血清中的TG、AST、ALT显著升高；与模型组比，利拉鲁肽组的TG、AST、ALT显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见图3。

图1 小鼠体质量（A）和肝指数（B）及3组小鼠肝脏外观图（C）

图2 肝组织病理染色结果（×20）

图3 各组小鼠血清中TG、AST、ALT的表达

2.4 小鼠肝组织中抗炎细胞因子IL4和IL-10 的表达 与模型组比，利拉鲁肽组IL-4（P＜0.05）和IL-10（P＜0.01）mRNA表达水平显著上升，且IL-4（P＜0.01）和IL-10（P＜0.01）浓度也显著上升，差异均有统计学意义。见图4。

2.5 利拉鲁肽对M2型巨噬细胞及标志物mRNA表达的影响 与模型组比，利拉鲁肽组M2型巨噬细胞比例显著上升，且CD206、CD301、MGL-1、MGL-2和Arg-1 mRNA表达量也显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见图5。

3 讨论

NAFLD在我国是除病毒性肝炎外的第二大肝病，可增加患者肝脏相关病死率和心血管疾病风险，其发病机制与胰岛素抵抗和代谢综合征密切相关[2]。目前临床上对于2型糖尿病NAFLD患者主要治疗方式为注射胰岛素或口服降血糖的药物，但经常令患者出现肥胖或血脂代谢紊乱等不良反应[10]。GLP-1是由肠道L细胞受营养素刺激而分泌的多肽类激素，已有研究发现GLP-1类似物利拉鲁肽可降低2型糖尿病患者的TG、TC水平[11]。RAHMAN等[12]也发现GLP-1在脂肪肝疾病的小鼠模型中改善胰岛素抵抗，提高胰岛素敏感性，且胰岛素抵抗与NAFLD密切相关[11，13]，提示利拉鲁肽对NAFLD具有治疗作用。在本研究中，模型组小鼠的体质量、肝指数、TG、AST、ALT明显升高，肝脏组织病变程度明显加重，证实NAFLD模型成立。与之前的研究结果[11，14]一致，本研究结果表明利拉鲁肽可以显著降低高脂饮食诱导的NAFLD小鼠的体质量、肝指数、TG、AST、ALT。一项小型早期试验表明利拉鲁肽改善肝脏组织学特征和肝功能[15]，本研究病理结果也显示脂肪性降低，这些结果证实了利拉鲁肽对2型糖尿病NAFLD具有降脂保肝的作用。

图4 小鼠肝组织中IL4和IL-10的表达

图5 利拉鲁肽对M2巨噬细胞及极化标志物mRNA的影响

巨噬细胞是人体非常重要的免疫细胞，可增强机体防御功能，不同亚型的巨噬细胞具有的功能也不一样，目前公认的巨噬细胞亚型为M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞，前者促炎作用，后者具有抗炎作用[16]。NAFLD主要的病理学特征为脂质以脂肪滴形式沉积于肝细胞中，肝脏内脂质的大量堆积[17]。研究发现，巨噬细胞可对肝脏细胞中的脂质代谢发挥重要作用[18]。在肝脏中，脂质的过氧化产物可激活NF-κB，活化后的NF-κB可促进多种炎性因子的表达，如IL-6可诱导机体产生胰岛素抵抗，TNF-α促进肝脏的氧化应激，令肝细胞发生凋亡；而M2型巨噬细胞可分泌抗炎细胞因子，增强肝细胞脂质分解，减少脂质的沉积，从而改善NAFLD的病理学特征[19]。MAINA等[20]研究发现，在NAFLD小鼠的肝脏组织中出现Ml/M2型巨噬细胞比例的增加，且WAN等[16]研究发现M2型巨噬细胞可诱导M1型巨噬细胞凋亡，减轻炎症反应和细胞损伤，说明M2巨噬细胞可对NAFLD发挥治疗作用。为了探究利拉鲁肽对M2巨噬细胞的影响，本研究检测了NAFLD小鼠肝脏组织中M2型巨噬细胞及其标志物的表达，结果显示利拉鲁肽可显著促进M2型巨噬细胞及其标志物的表达，且本研究结果还表明利拉鲁肽显著促进了NAFLD小鼠IL-4和IL-10 的表达水平。IL-4和IL-10 作为是机体重要的抗炎细胞因子，能诱导巨噬细胞极化成M2型巨噬细胞[21-22]。以上结果说明利拉鲁肽可通过促进IL-4和IL-10的表达极化M2巨噬细胞，提高NAFLD小鼠肝脏组织中M2巨噬细胞的比例。

综上所述，利拉鲁肽能显著降低高脂饮食诱导的NAFLD小鼠的体质量、肝指数、TG、AST和ALT的增加，改善肝脏组织的脂肪变性，说明利拉鲁肽对2型糖尿病NAFLD具有治疗作用；其作用机制可能通过促进IL-4和IL-10的表达极化M2型巨噬细胞从而改善2型糖尿病NAFLD。