紫外分光光度法测定大枣中总黄酮的研究

李莲芳 杨丽莉 龙艳昆 李娟

摘要：目的 建立大枣中总黄酮含量的测定方法。方法 以芦丁为对照品，在275nm波长下测定总黄酮在三氯化铝甲醇溶液中的吸光度，计算大枣中总黄酮的含量。结果 大枣中总黄酮含量为0.41%。结论 方法简便易行，适用于大枣中总黄酮含量的测定。

关键词：大枣;总黄酮;紫外分光光度法

中图分类号：R914   文献标志码：A   文章编号：1007-2349（2019）08-0075-03

大枣为鼠李科（Rhamnaceae）枣属（Ziziphus）植物枣（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果实，为常用中药之一，《神农本草经》列为上品。味甘，性温，归脾、胃经。为补中益气、养血安神、缓和药性的常用中药，用于脾虚食少、乏力便溏、妇人脏躁等，国内外应用前景广阔。黄酮类化合物是大枣的化学成分之一，大枣中富含多种黄酮，如芦丁、槲皮素、当药黄素等，这些黄酮类化合物对血管有舒张作用，能拮抗血小板活化因子作用，可清除自由基，抑制生物膜上不饱合脂肪酸的过氧化而具有抗氧化作用，同时可延长戊巴比妥干预睡眠时间起到镇静作用[1]。目前，根据文献报道[2]，测定大枣中总黄酮的含量主要采用的方法

是比色法，经过实验发现，此方法测试前的测试液有红色絮状沉淀，我们将其过滤，其吸光度大大减小，因此，笔者认为，比色法不适宜用于大枣中总黄酮的含量测定。本文的目的是建立紫外分光光度法测定大枣中总黄酮含量的方法。

1 方法理论依据

黄酮广泛存在于许多植物的茎、叶和果实中，其基本结构是2-苯基色原酮，母核上常有-OH、-OCH3等取代基，并常以苷的形式存在。大枣中的黄酮主要是芦丁、当药黄素等。其化学结构如下：

在下述结构中，黄酮母核上所含的游离羟基能与铝盐形成络合物[3]。

此络合物在紫外区有特征吸收峰，可用于测定黄酮含量。以芦丁为例，芦丁与AlCl3反应形成络合物的特征吸收峰图谱见图1。

2 实验部分

2.1 仪器与试药

2.1.1 材料与试药 大枣由云南金发药业有限公司提供，经该公司质量部门鉴定为大枣（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果实;芦丁对照品（批号：HL-180122，纯度≧98%，购自昆明市官渡区卓达仪表仪器经营部）;蒸馏水;实验所用的其它试剂均为分析纯，购自昆明市官渡区卓达仪表仪器经营部。

2.1.2 仪器 紫外可见分光光度计（型号：UV-1800PC-DS，上海美诺达仪器有限公司）;天子分析天平（型号：LAC-224C，常熟市梦兰百灵天平仪器有限公司）;水浴锅（型号：DK-98-IIA）;回流提取装置。

3 方法与结果

3.1 样品溶液制备 取大枣药材（60℃条件下干燥7h），粉碎，取大枣粉末约1 g，加60%乙醇20 mL，称定重量，回流提取2 h，密塞冷却，用60%乙醇补足减失的重量，水浴锅上加热，趁热过滤，取续滤液作为样品溶液。

3.2 大枣黄酮和芦丁的吸收光谱特性 取4个25 mL容量瓶，1、2号各加入1 mL大枣黄酮样品溶液，3、4号各加1 mL芦丁标准溶液（0.248 mg/mL），在2、4号各加入1 mL 2% AlCl3溶液，摇匀，4个容量瓶都用甲醇定容，混匀后放置30分钟，分别置于1 cm石英比色皿中，1、3号以甲醇作为空白溶液，2、4号以1 mL 2% AlCl3溶液同法制备空白溶液，用紫外-可见分光光度计在200～500 nm波长范围内进行全程扫描。吸收峰图谱见图2。

从图2可见，在紫外区，在甲醇溶液中，芦丁的最大吸收波長为258 nm，大枣总黄酮最大吸收波长为260 nm;在三氯化铝甲醇溶液中，芦丁的最大吸收波长为275 nm，大枣总黄酮的最大吸收波长为270 nm。三氯化铝的存在使大枣总黄酮和芦丁的吸收峰都发生了红移，最大吸收峰几乎重合，从图谱上看，大枣总黄酮的波峰没有芦丁的波峰尖，经过对大枣总黄酮波峰附近的吸收度进行对比，在270～275 nm区间的吸光度差别不大，差别在0.005～0.001之间，因此，可以以芦丁为标准在275 nm测定大枣总黄酮含量。

3.3 测定条件的确定

3.3.1 三氯化铝溶液用量的确定 为了确定2% AlCl3的最佳用量，取大枣黄酮样品溶液和芦丁标准溶液各1 mL，分别置于25 mL容量瓶中，按以下2% AlCl3的量分别加入，摇匀，用甲醇定容，放置30 min，在紫外-可见分光光度计上测定了不同AlCl3用量时，大枣总黄酮和芦丁的吸光度，测定结果见表1。

从表1可见，随着2% AlCl3溶液用量的增加，吸光度趋于增大，但用量超过0.5 mL后，吸光度变化不大，但芦丁吸光度随着AlCl3用量的增加有少量增大的趋势，这可能跟芦丁与AlCl3反应后有显色吸收有关系，为了能使样品中的黄酮类化合物反应充分，我们将2% AlCl3的用量定为1 mL。

3.3.2 反应时间与稳定性的确定 取大枣黄酮样品溶液1 mL，芦丁标准溶液1 mL，分别置于25 mL容量瓶中，各加入1 mL 2% AlCl3溶液，甲醇定容后放置不同时间，在紫外-可见分光光度计上测定吸光度，测定结果见表2。

从表2可见，反应液放置20～30 min，吸光度已经基本稳定，在60 min内变化很小，据此确定反应时间为30 min。

3.4 样品测定方法

3.4.1 标准溶液的制备 精密称取芦丁标准品10 mg，用甲醇溶解，甲醇定容于50 mL容量瓶中。

3.4.2 标准曲线的建立 分别取0、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0 mL标准溶液于25 mL容量瓶中，各加2%AlCl3溶液1 mL，摇匀，用甲醇定容，混匀后放置30min，以不加标准品溶液同法制备空白溶液，测定吸光度值。记录标准溶液测定项下系列标准溶液的吸光度值，以浓度（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标，绘制标准曲线。得回归方程为Y=0.0417X+0.0027，r=0.9999。结果表明，芦丁检测浓度在4.96～19.84 μg/mL范围内与吸光度呈良好线性关系。

3.4.3 大枣中总黄酮的测定 按照3.1项的操作制备大枣样品溶液，精密吸取大枣样品溶液1 mL，于25 mL容量瓶中，按照标准曲线项下方法操作，测定吸光度，由回归方程求出稀释液中总黄酮浓度，然后计算大枣药材中总黄酮的百分含量。

3.5 方法学考察 分别考察紫外可见分光光度法测定大枣总黄酮方法的精密度、重复性和加样回收率。

3.5.1 精密度考察 精密量取芦丁标准品溶液5份，各1 mL，按照标准曲线项下操作平行测定吸光度，计算RSD值为0.41%（n=5），說明精密度、准确度良好，测定结果见表3。

3.5.2 重现性考察 取同一批次大枣样品5份，按照3.1项的操作制备大枣样品溶液，按照3.4.3 项下测定大枣中总黄酮含量，计算RSD值为3.23%（n=5），说明重现性良好，测定结果见表4。

3.5.3 大枣总黄酮含量测定 取大枣样品1份，按照3.1项的操作制备大枣样品溶液，精密量取样品溶液1 mL，共5份，按照3.4.3项下测定吸光度，计算RSD值为0.26%（n=5），通过计算大枣样品中总黄酮含量为0.41%，测定结果见表5。

3.5.4 回收率实验 称取已知总黄酮含量（0.41%）的大枣样品5份，在每份大枣样品中准确加入0.21 mg/mL芦丁对照品溶液10 mL，按照3.1项的操作制备大枣样品溶液。精密吸取上述测定溶液各1.5 mL，于25 mL容量瓶中，按照标准曲线项下方法操作，测定吸光度，由回归方程求出稀释液中总黄酮浓度，计算加样回收率，测定结果见表6。可知，平均回收率为92.86%，RSD为3.06%（n=5）。

4 结论

本实验采用紫外分光光度法测定了大枣中总黄酮的含量，方法学考察实验证明该法符合微量成分分析的要求，有一定实用价值。操作具有方便快捷、操作简便、成本低的优点，值得推广使用。

参考文献：

[1]刘世军等.大枣化学成分的研究进展[J].云南中医学院学报.2015.38（3）：96-99.

[2]沈广志等.分光光度法测定大枣中总黄酮含量[J].微量元素与健康研究.2011.28（4）：26-27.

[3]林维宣等.紫外分光光度法测定山楂中总黄酮的研究[J].大连轻工业学院学报.1993.12（2）：42-50.

（收稿日期：2019-04-29）