左氧氟沙星与莫西沙星对结核分枝杆菌交叉耐药性的体外研究

(太原市第四人民医院，山西 太原 030053)

2018年世界卫生组织全球结核病年度报告提出，2017年中国结核病病死率0.04(0.04～0.05)，MDR-TB/RR-TB发病人数为7.3(5.5～9.4)万人，新发肺结核患者中MDR-TB/RR-TB为7.1%(5.6～8.7)，复治结核患者中MDR-TB/RR-TB为24%(20～28)[1]。氟喹诺酮类，尤其是左氧氟沙星和莫西沙星在MDR-TB/RR-TB的治疗中起到了重要作用，WHO也将氟喹诺酮类药物是治疗耐药结核病的核心药物[2，3]。随着氟喹诺酮类药物使用的不断增加，临床上的不规范用药，已出现对左氧氟沙星和莫西沙星耐药的菌株，这对MDR-TB/RR-TB的治疗是非常严峻的挑战。目前关于左氧氟沙星与莫西沙星的交叉耐药性暂无指导意见。有文献表明，LVF与MFX为非完全交叉耐药，对LVF低浓度耐药的患者可考虑用MFX代替LVF,高浓度耐药则避免使用氟喹诺酮类药物。本研究以比例法药敏为依据，研究左氧氟沙星与莫西沙星的交叉耐药性，为临床是否使用MFX代替LVF用于MDR-TB/RR-TB的治疗方案提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集太原市第四人民医院2016年8月～2018年12月住院肺结核患者经痰罗氏结核分枝杆菌培养及菌型鉴定确诊的病例，选取其中行罗氏结核菌药敏的痰标本319例。319例标本中，男171例，女148例。年龄分布18～79岁。

1.2 方法

1.2.1 罗氏结核菌培养 患者痰标本经N-乙酰-L-半胱氨酸=氢氧化钠(NAC-NaOH)去污，离心后，弃去上清液，采用改良固体培养基对沉淀物进行平行接种，接种后第3天和第7天观察培养情况，此后每周观察一次，直至第8周。操作过程遵照《分枝杆菌分离培养操作程序及质量保证手册》中的标准化操作程序执行。

1.2.2 罗氏比例法药敏 qu采用临界药物浓度和临界耐药菌比例两个切值来限定有临床意义的耐药性。取培养基上生长良好的临床分离株，研磨 分散 ，用生理盐水稀释成1 mg/mL的菌悬液，逐步稀释成将菌量分别为10～2 mg/mL和10～5 cfu /管(相差100倍)接种于含药和无药培养基斜面上，培养后4周后读取含药和无药斜面上菌落数，计算耐药百分比。耐药百分比=含药培养基上生长的菌落数/对照培养基上生长的菌落数×100%。若耐药百分比大于等于1%，则认为受试菌对抗结核药耐药。操作过程遵照《结核分枝杆菌药物敏感性试验操作程序及质量保证手册》中的标准化操作程序执行。

1.2.3 菌型鉴定 结核分支杆菌复合群具有生长缓慢(通常3周，有时达6周)，不产生色素，在罗氏培养基斜面上菌落具有粗糙，皱褶，淡黄色和干燥的典型的特点。在PNB罗氏培养基上，接种104 cfu/mL分离培养物，35～37℃培养4周后观察生长情况，和对照培养基相比有菌落生长者为非结核分支杆菌，未生长菌落或有几个菌落生长为结核分支杆菌复合群。

2 结果

319例肺结核病例中，左氧氟沙星耐药为38例，耐药率为11.91%(38/319)。莫西沙星耐药16例，耐药率为5.02%(16/319)，莫西沙星的耐药率低于左氧氟沙星。左氧氟沙星敏感菌株中100%(218/218)对莫西沙星敏感。左氧氟沙星耐药菌株中42.1%(16/38)对莫西沙星耐药，57.9%(22/38)对莫西沙星敏感。莫西沙星耐药菌株中100%(16/16)对左氧氟沙星耐药。见表1。

表1 左氧氟沙星与莫西沙星耐药情况 例

以上结果提示：左氧氟沙星与莫西沙星对结核分枝杆菌存在单向交叉耐药。

3 讨论

随着研究的不断深入，已有足够的证据表明氟喹诺酮类药物(FQs)对结核分枝杆菌有很强的杀菌与灭菌能力，2016年世界卫生组织将氟喹诺酮类药物中的左氧氟沙星 莫西沙星 加替沙星列为治疗耐多药结核病的A组核心药物[3]，足见该类药物在结核病治疗中的作用。FQs类药物的作用机制为作用于MTB的脱氧核糖核酸(DNA)旋转酶(拓扑异构酶)，阻止DNA的复制，转录而发挥抗MTB的作用[2]。莫西沙星是第四代超广谱氟喹诺酮类抗生素，它的结构特点是在FQs分子结构的第8位碳原子带入甲氧基[4]。左氧氟沙星与莫西沙星的抗MTB的MIC分别为0.25～1.01 mg/L，0.125～0.5mg/L，Mfx的体外抗菌活性是Lfx的2倍[5]。而2015年中国耐药结核病指南提出，如左氧氟沙星(第三代氟喹诺酮类药物)耐药时第四代氟喹诺酮类药物(莫西沙星，加替沙星)是否有效尚不能肯定，这时应用第四代氟喹诺酮类药物不一定有效。本实验研究表明，以比例法药敏为金标准，在山西省，左氧氟沙星与莫西沙星存在单向交叉耐药，对左氧氟沙星耐药的结核分枝杆菌对莫西沙星可能敏感，对莫西沙星耐药的患者对左氧氟沙星均耐药。值得注意的是，WHO在“结核病耐药性监测指南第四版”中将莫西沙星和左氧氟沙星的耐药界限定为MIC=0.25 mg/L和MIC=2.0 mg/L，这可能将不少对莫西沙星敏感的菌株界定为耐药株[5]。这种划分的合理性有待进一步验证。

氟喹诺酮类药物耐药多发生在gyrA和gyrB这两个基因上，gyrB基因突变发生率较gyrA基因低的多，gyrB突变通常与低浓度氟喹诺酮类药物耐药相关[6]。gyrA基因突变是我国人群对氟喹诺酮类药物耐药菌株最主要的耐药机制,不同gyrA突变类型导致对氟喹诺酮类药物不同的耐药水平。gyrA基因密码子90、91、94是最常见突变位点，其中94编码的天冬氨酸为丙氨酸、天冬酰胺、组氨酸所置换，占耐药突变株的42%。有研究结果显示，密码子94位点突变往往伴有更高的MIC值，即产生了高浓度耐药；而密码子91位点突变伴有低浓度耐药[7]。第94位点突变类型较多,导致不同的耐药水平。有研究表明，第94位点天冬氨酸突变为天冬酰胺时左氧氟沙星和莫西沙星的高水平耐药比例分别为30.0%(3/10)和100.0%(10/10);94位点天冬氨酸突变为半胱氨酸的菌株同时表现为对2种氟喹诺酮类药物的高水平耐药;而第94位点突变为丙氨酸时与低水平氟喹诺酮类药物耐药有关，对左氧氟沙星和莫西沙星低水平耐药率分别为100.0%(12/12)和58.3%(7/12)[8]。该研究显示，左氧氟沙星与莫西沙星为不完全交叉耐药。

也有研究显示，在复治肺结核患者结核分枝杆菌临床分离株对氟喹诺酮类药物的体外交叉耐药性表明，使用最低抑菌浓度法检测结核分枝杆菌对左氧氟沙星，莫西沙星的敏感性，对lfx耐药菌株中8.1%(3/37)同时耐mfx，3对mfx耐药的菌株同时耐lfx。而使用MGIT960检测结果显示，对lfx耐药菌株中100.0%(21/21)耐mfx，耐mfx的菌株中47.7%(21/44)耐lfx[9]。研究提示，复治肺结核患者临床分离株LFX与mfx之间存正向交叉耐药率较低，临床治疗最好结合MIC值检测结果而择优用药[10]。

本研究提示以比例法药敏为参考标准，左氧氟沙星与莫西沙星对结核分枝杆菌存在单向交叉耐药，对左氧氟沙星耐药的结核分枝杆菌对莫西沙星大部分仍然敏感，为选择氟喹诺酮类药物治疗耐药结核病方案提供参考了依据，基于目前各个实验室研究氟喹诺酮类药物对结核分枝杆菌的耐药性方法不同，研究结果不尽相同，还需对左氧氟沙星与莫西沙星交叉耐药性做进一步试验研究。

结核病是危害人类生命健康的主要传染性疾病之一，中国是结核病与耐药结核病高危国家之一，鉴于氟喹诺酮类药物之间的交叉耐药性，左氧氟沙星与莫西沙星交叉耐药性还需进一步试验研究。