6种红菇的形态学及rDNA-ITS测序鉴定

田慧敏 刘铁志

（赤峰学院生命科学学院，内蒙古赤峰024000）

红菇属（Russula Pers.）隶属于担子菌门（Basidiomycotina），伞菌纲（Agaricomycetes），红菇目（Russulales），红菇科（Russulaceae）是高等担子菌的重要类群之一[1]，主要形态特征为菌盖颜色多样:红色、黄色、橙色、白色、绿色、褐色、黑色和蓝色等，子实体菌丝组织中有较多膨大的球状细胞，菌丝无锁状联合，菌柄和菌肉较脆，菌柄常中空，孢子印白色至深黄色，孢子表面淀粉质，有疣刺状纹饰[2-3]。红菇属真菌是一类世界广泛分布且种类众多的真菌，本属的绝大多数种通常与松属、落叶松属、冷杉属、铁杉属、云杉属等裸子植物，以及壳斗目、杨柳目、豆科、蓼科等种子植物形成外生菌根，在大型伞菌的系统学和菌根学的研究中占有重要的地位[4]。据统计，我国现有红菇属包含158个分类单元，包括152种，1亚种，5变种[5]。红菇是一种食药兼用的大型真菌，具有很高的营养价值，含有丰富的氨基酸，多数为人体必需氨基酸和各类维生素。红菇外形美观，口感鲜美，风味独特，享有“菇中之王”的美称，红菇中含有的多糖具有抗癌作用，对其进行研究具有深远的意义和广阔的前景[6-7]。但是红菇属真菌的担子果形态、颜色、孢子、担子等结构容易随着温度、湿度等环境条件的变化而变化，在鉴定过程中仅用形态来进行特征分类法鉴定区分容易产生较大的错误和争议。因此笔者辅以分子手段对标本进行鉴定使结果更加具有说服力、更加准确。内蒙古赛罕乌拉国家级自然保护区、松山区神仙沟和盔甲山自然风景区等地区主要植被为油松、落叶松、白桦、杨、柳、榛子等，气候凉爽湿润，适合红菇属真菌的生长，对该地红菇属真菌的准确鉴定具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 供试标本来源

供试标本CFSZ 10356、CFSZ 10391、CFSZ 11336、CFSZ 13005、CFSZ 13010和CFSZ 13020于2013年8月和2016年8月、9月采集于赛罕乌拉国家级自然保护区、松山区神仙沟自然风景区、盔甲山自然风景区，在拍摄生境照片后，观察形态、测量数据，晾干、编号，超低温冷冻处理后存放于赤峰学院菌物标本室（CFSZ）。

1.2 形态鉴定

采用宏观特征、显微结构与化学试剂反应相结合的方法，观察新鲜子实体大小、形状、颜色、附属物、菌褶着生方式、菌柄等宏观特征，用游标卡尺测量菌盖和菌柄大小，颜色的判断主要依据采集时拍摄的彩色照片。宏观特征使用体式显微镜（江南JSZ6）来观察测量，数量特征以测定2～5个子实体为依据；显微结构观察测量孢子、担子、褶侧囊体、褶缘囊体、菌盖和菌柄表皮囊状体、菌丝等结构。孢子大小以30个不同孢子的长宽范围为依据，担子等其他特征以10～20个测量数据为准。将标本的组织材料做成徒手切片，通常以4%～5%的KOH溶液作为浮载剂。担子的测量数据包括小梗，菌丝和菌髓等的淀粉质反应或类糊精反应是将材料置于Melzer氏试剂（碘0.5 g，碘化钾1.5 g，水合氯醛22 g，蒸馏水20 mL）中来判断。然后根据文献进行鉴定和分类，用显微照相系统（Olympus BX53）拍摄显微结构相片。孢子测量Q1（长宽比范围）和Q2（长宽比平均值），Q2=Q（平均值）±Qsd（标准误）。

1.3 ITS测序鉴定

1.3.1 基因组DNA的提取

干品子实体菌盖部分经过研磨称量后，使用北京鼎国公司生产的DNA纯化试剂盒提取其基因组DNA。

1.3.2 rDNA-ITS区PCR扩增及测序

扩增反应在德国eppendorf公司的5331型扩增仪上进行。PCR体系反应总体积为50 μL PCRcolorless mix25 μL；20 μmol∕L ITS1∕ITS4 引物各 1 μL;模板DNA 2 μL；ddH2O22 μL。

PCR条件94℃预变性3 min，95℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸 1 min，共34个循环，最后于72℃补平5 min，终止温度为4℃。

1.3.3 rDNA-ITS的鉴定

6个供试标本的PCR扩增产物，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物胶回收纯化后委托上海生工生物科技有限公司完成。将已测得的ITS序列，通过Chromas软件进行处理，整理出清晰的ITS序列，将得到的ITS序列在GenBank和UNITE数据库中进行Blast检索，从结果中挑选出同源性较高的ITS序列，然后使用软件MEGA5.1构建发育树，比较亲缘关系，鉴定到种。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

根据担子果宏观形态、微观结构等特征鉴定结果:标本CFSZ13020鉴定为褪绿红菇R.atroglauca Einhell.，CFSZ 10356鉴定为佩拉妮娅红菇R.pelargonia Niolle.，CFSZ 10391鉴定为非白红菇R.exalbicans Melzer&Zvára.，苋菜红菇 R.depallens Fr.，CFSZ 13005鉴定为菱红菇R.vesca Fr.，香红菇R.odorata Romagn。

2.1.1 褪绿红菇Russula atroglauca Einhell.

子实体中等大。菌盖直径2.7～5.6 cm，初半球形，后渐平展，中央稍下凹，边缘有时上翘，具短条纹，菌盖灰绿色，中央色深，干后灰黑色，光滑，湿时稍粘，表皮下白色，菌肉白色、薄，约1～2 mm，无明显气味，伤不变色。菌褶米白色，干后变土黄色，直生，不等长、稀。菌柄长3.6～4.9 cm，粗1.1～1.5 cm，圆柱形向下渐细，白色中实（图1，A、B）。

图1 褪绿红菇R.atroglauca Einhell.采集样品子实体形态及微观结构

孢子（6～8.5）μm×（5～7）μm[（Q1=（1～1.64），Q2=1.25±0.19]，孢子宽椭圆形或近球形，浅黄色，有独立的小疣，淀粉质（图1，C）。担子（26～45.5）μm×（5～12）μm，棒状，上部膨大，无色，有四个小梗（图1，D）。褶侧囊状体（67.5～98）μm×（7～12）μm，梭形，无色，顶端较细（图1，E）。菌褶泡囊细胞无色，近球形，直径（24～43）μm（图1，F）。菌盖表皮菌丝直立，淡黄色，顶端钝圆，稍膨大，细长，棒状，（41～80）μm×（5～7）μm（图1，G、H）。菌柄表皮菌丝排列杂乱，无色，分枝，有隔膜，直径（3～5）μm。

研究标本:2016年8月20日，由田慧敏、田博宇、宋文鹏采集于内蒙古赤峰市松山区盔甲山自然风景区杂木林地上，CFSZ 13020。

该标本与铜绿红菇R.aeruginea，灰绿红菇R.grisea外形相似，但是该标本湿时灰绿色，表面稍粗糙，干后变为灰黑色，孢子大小为（6～7.7）μm×（4.8～6.7）μm，而铜绿红菇R.aeruginea菌盖铜绿色或黄绿色不变色，孢子偏大（6～10）μm×（5.5～9.5）μm[8-10]；而灰绿红菇菌盖青灰色或紫灰色，中部常褪为淡粉灰色，侧囊体偏小（64～80）μm×（7～14）μm[9]，CFSZ 13020菌盖全绿色，中央稍具紫色色调，干后色深，且囊状体较大（67.8～98.4）μm×（7.2～12）μm；标本CFSZ13020与R.atroglauca描述吻合，属异褶亚属subgen.Heterophyllidia Romagn，异褶组 sect.Heterophyllinae，灰色亚组subsect.Grisinae，该种分布于欧洲[10-11]，我国没有分布，为中国新记录种，经济价值不明。

2.1.2 香红菇Russula odorata Romagn

子实体中等大，菌盖直径2.7～5.6 cm，起初半球形，后渐平展，中央稍下凹，边缘有时上翘，具短条夹纹，菌盖灰绿色，中央色深，干后灰黑色，光滑，湿时稍粘，表皮下白色，菌肉白色、薄，约1～2 mm，无明显气味，伤不变色。菌褶米白色，干后变土黄色，直生，不等长、稀。菌柄圆柱形向下渐细，白色，长3.6～4.9 cm，粗1.1～1.5 cm，中实（图2，A、B）。

图2 香红菇R.odorata Romagn采集样品子实体形态及微观结构

孢子（7.5～9.0）μm×（6.0～8）μm（Q1=1.25～1.44，Q2=1.28±0.21），宽椭圆形或近球形，浅黄色，有独立的小疣，淀粉质（图2，C）。担子（16.8～36）μm×（8.4～12）μm，棒状上部膨大，无色，内含有大油滴，有四个小梗（图2，D）。褶侧囊状体（36～55.2）μm×（7.2～12）μm，梭形，无色，内含黄色颗粒，（图2，E）。菌盖表皮囊状体丰富，棒状，顶端稍膨大，具隔膜，有的隔膜多，直径3.8～7.8 μm（图2，F、G）。菌柄表皮由无色菌丝和胶化菌丝组成，胶化菌丝有黄色内含物，直径为6～8 μm；无色菌丝排列杂乱，分枝，有隔膜，直径3.6～4.8 μm，菌柄由无色菌丝组成，菌丝顶端稍膨大，直径为3～4.8 μm。

研究标本:2016年9月10日，由田慧敏采集于赤峰市松山区神仙沟自然风景区阔叶林白桦树下，CFSZ 11336。

该标本主要特点是菌盖浅黄色，菌盖表皮具隔膜的囊状体，由于其颜色与我国报道的有较大差异，鉴定过程中较为困难，分子鉴定结果显示，该种与多色红菇R.versicolor、脆红菇R.fragilis相似度较高。而R.versicolor菌盖赤褐色至浅赤褐色，边缘黄褐色、酒红色至粉紫色，R.fragilis菌盖主要为紫色色调，并夹杂有多种色调，且菌肉有苦味，二者菌盖表皮均无囊状体[2，10，12]，与研究标本差别较大。而标本有微弱的黄绿色调，可能是褪色后的特征，其他特征都与香红菇R.odorata相符，故鉴定为R.odorata，属于异褶亚属subgen.Heterophyllidia Romagn，美丽组sect.Tenellula，subsect.Puellarinae，该种于2014年首次报道，分布于吉林和内蒙古[2]，经济价值不明。

2.1.3 佩拉妮娅红菇Russula pelargonia Niolle.

子实体中等，3.6～5.3 cm，扁半球形，中部稍下凹，边缘具条纹，菌盖暗紫灰色，中央色深。表皮整体易剥落，菌肉白色，表面光滑，湿时稍粘，表皮下淡红色，无明显气味，伤不变色。菌褶白色，干后变土黄色或灰黄色，不等长，分叉，近直生。菌柄圆柱形向下渐粗，白色，长 2～4 cm，粗0.5～0.7 cm，中空（图3，A、B）。

担孢子（7.2～9.5）μm×（6.2～8.2）μm（Q1=1.0～1.5，Q2=1.21±0.11），宽椭圆形，无色，含油球，有1小尖，有独立的长刺，淀粉质（图3，C、D）。担子（26.0～43.0）μm×（9.5～12）μm，棒状，上部膨大，无色，有四个小梗（图 3，E）。褶侧囊状体（45.0～62.5）μm×（7.2～13.5）μm，梭形，无色。菌褶泡囊细胞无色，椭圆形、近方形或近球形，直径（24～38.5）μm×（9.2～26.5）μm（图3，F）。菌盖表皮由杂乱的菌丝组成，表皮囊状体多，（36～62.5）μm×（5.3～9.5）μm，棒状，上部膨大，无色，菌丝无色，分枝，有隔，直径2.5～5.0 μm（图3，G），菌柄表皮囊状体少，（38～67）μm×（5.3～9.5）μm，形状同表皮囊状体，菌丝无色，直径2.4～5.0 μm。

研究标本:2013年8月17日，由刘铁志、田慧敏、万威、吴晶采集于内蒙古赤峰市巴林右旗（43°12′～44°28′N，118°11′～120°05′E），赛罕乌拉自然保护区，庆云山景区，杂树林地上，散生，CFSZ10356。

该标本与R.innocua、堇紫红菇R.violacea、R.azurea和花盖菇R.cyanoxantha相似，而R.innocua菌盖浅灰绿色，孢子较大（8～11）μm×（6.4～8.5）μm，菌盖表皮囊状体和菌丝顶端很大都较该标本大；R.violacea菌盖堇紫色、丁香紫色，菌褶后期变为黄色，R.azurea菌盖葡萄紫色，颜色很暗，中间具颗粒状物或粉状物，菌盖表皮许多菌丝附结晶[8-10]；R.cyanoxantha菌肉无味，孢子很大长达12 μm，褶侧囊体很多，无表皮囊体[9]。标本菌盖暗灰紫色，孢子（7.2～9.6）μm×（6.2～8.2）μm，有长刺，往往有脊线相连，菌盖表皮菌丝细长，不具附属物，形态学特征与R.pelargonia相符[10-13]，因此鉴定为R.pelargonia，红菇亚属subgen.Russula Romagn，红菇组sect.Russula，紫罗兰亚组subsect.Violacinae。该种分布于欧洲、亚洲太平洋西南，俄罗斯[14]。在中国没有分布，为首次描述记录，为中国新记录种。

图3 佩拉妮娅红菇R.pelargonia Niolle.采集样品子实体形态及微观结构

2.1.4 苋菜红菇Russula depallens Fr.

子实体中等，3.5～7 cm，扁半球形，中部稍下凹，边缘平滑，具明显条纹，菌盖淡粉色、紫红色、中央色深，后期有的褪色，表面光滑，湿时粘，表皮1∕2易剥落，菌肉白色，表皮下淡红色。无明显气味，伤不变色。菌褶白色，干后变土黄色，不等长，有短菌褶，近直生。菌柄圆柱形，等粗，白色，伤变赭色，有的上部有淡粉色，长6～8 cm，粗0.9～1.5 cm，中空（图4，A、B）。

孢 子（7.2～12） μm ×（6.5～8.0） μm（Q1=1.03～1.40，Q2=1.21±0.11），宽椭圆形，无色，有一小尖，独立的长刺，刺间无连线，淀粉质（图4，C）。担子（33.5～44）μm×（9.5～13）μm，棒状，上部膨大，无色，有四个小梗，梗长达6～7.2 μm（图4，D）。褶侧囊状体（48～96）μm×（7～12）μm，披尖形，有黄色内含物，顶部有长柄，长达5～9.5 μm（图4，E）。菌盖表皮菌丝直立，无色透明，宽1.5～4 μm，部分膨大，末端钝圆，有黄色内含物，有的具隔膜，膨大部分宽7～9.5 μm（图 4，F）。菌柄表皮由菌丝和泡囊细胞组成，菌丝无色，分隔，直径3～5 μm。菌褶泡囊细胞无色，椭圆形、近球形，（14.4～45.5）μm×（14.4～33.5）μm（图4，G）。

研究标本:2013年8月17日，由刘铁志、田慧敏、万威、吴晶采集于内蒙古赤峰市巴林右旗（43°12′～44°28′N，118°11′～120°05′E），赛罕乌拉自然保护区，庆云山景区，白桦林地，散生，CFSZ 10391。

分子水平分析显示该标本与变红红菇R.renidens、非白红菇R.exalbicans相似，但是非白红菇菌盖酒红色，褶侧囊体小，最大的可达70 μm，菌肉辣味，菌盖表皮具有囊状体[5，10]。而该标本菌盖多为苋菜红色，后期会有褪色现象，褶侧囊体很大（48～96）μm×（7.2～12）μm，菌盖表皮无囊状体，为红菇亚属subgen.Russula，sect.Russula，类全缘亚组subsect.Integroidinae。该种在国内分布广泛，但是内蒙古地区未见报道，为内蒙古新记录种，可食用[8-9]。

2.1.5 非白红菇Russula exalbicansMelzer&Zvára.

子实体中等大，菌盖直径2.7～5.6 cm，起初半球形，后渐平展，中央稍下凹，边缘有时上翘，具短条纹，菌盖灰绿色，中央色深，干后灰黑色，光滑，湿时稍粘。表皮下白色，菌肉白色，薄，约1～2 mm，无明显气味，伤不变色，有辣味。菌褶白色，干后变浅黄色，孢子印奶白色，直生，不等长，稀。菌柄圆柱形向下渐细，白色长 3.6～4.9 cm，粗 1.1～1.5 cm，中实（图5，A、B）。

孢 子（7.2～12）μm ×（5.0～10）μm（Q1=1.25～1.44，Q2=1.28±0.21），宽椭圆形或近球形，浅黄色，有小疣，小疣之间有脊线相连，淀粉质（图5，C）。担子（21.5～47.5）μm×（9.5～12）μm，棒状上部膨大，无色，内含有大油滴，有四个小梗（图5，D）。褶侧囊状体（38.4～70）μm×（7.2～12）μm，梭形，无色，内含黄色颗粒（图5，E）。菌盖表皮囊状体丰富，（41～80.4）μm×（8～12）μm，细长，棒状，顶端膨大（图5，F、G）。菌柄表皮菌丝皮排列杂乱，无色，分枝，有隔膜，直径3～5 μm。

图4 苋红红菇R.depallens Fr.采集样品子实体形态及微观结构

研究标本:2016年8月30日，由田慧敏、田博宇、宋文鹏采集于内蒙古赤峰市松山区城子乡盔甲山自然风景区杂木林林地上，CFSZ 13010。

该标本与细弱红菇R.gracillima相似，而细弱红菇菌盖紫褐色、暗紫色至褐紫罗兰色，不褪色，菌盖表皮膨大菌丝无色，没有内含物[7，12]。而标本菌盖酒红色，有时褪色，菌盖表皮具囊状体。该标本与非白红菇 R.exalbicans相符[5，10-11]，为红菇亚属 subgen.Russula Romagn，红菇组sect.Russula，辣味亚组subsect.Sardoninae，该种为内蒙古新记录种，可食用。

2.1.6 菱红菇Russula vesca Fr.

子实体中等大，菌盖直径3.6～4.6 cm，起初半球形，后渐平展，边缘内卷，红褐色、棕褐色，伤色变深，表面光滑，湿时稍粘，表皮下白色（图6，A）。菌肉白色，薄，约1～2 mm，无明显气味，伤不变色。菌褶白色，干后变黄色，直生，不等长，密。菌柄圆柱形向下渐细，白色，伤变赭色，中实，长3.2～4.5 cm，粗1～1.4 cm。

孢 子（6～9）μm ×（5～6）μm（Q1=1.04～1.5，Q2=1.35±0.15）宽椭圆形或近球形，浅黄色，有独立的小刺，中间有一大油滴，淀粉质（图6，B）。担子（29～48）μm×（6～9.5）μm，棒状上部膨大，无色，有浅黄色内含物有四个小梗，梗长4～5 μm（图6，C）。囊状体少，梭形，内含黄色内含物，（50～77）μm×（9.5～11.5）μm（图6，D）。菌褶泡囊细胞无色，近球形，直径（20～33.5）μm×（14.4～22）μm，菌盖表皮菌丝有的具2.4～4.3 μm，细长，棒状，有的顶端变细，淡黄色（图5E），菌柄表皮菌丝排列杂乱，无色，分枝，有隔膜，直径2.4～5 μm。

研究标本:2016年8月30日，牛梦枝采集于内蒙古赤峰市松山区城子乡盔甲山自然风景区油松林地上，CFSZ 13005。

图5 非白红菇R.exalbicans Melzer&Zvára.采集样品子实体形态及微观结构

图6 菱红菇R.vesca Fr.采集样品子实体形态及微观结构

该种主要特点是菌盖颜色多变，标本菌盖颜色为红褐色，菌盖表皮菌丝直立，宽2.4～4.3 μm，也发现有的微黄色，顶端变细，属异褶亚属subgen.Heterophyllidia Romagn异褶组sect.Heterophyllinae Maire；subsect.Heterophyllinae异褶亚属subgen.Heterophyllidia Romagn。该菌可食用，味道鲜美，含有多种营养成分[2，8-9，16]。

2.2 rDNA-ITS测序鉴定结果

供试样品子实体DNA序列PCR扩增产物测序结果为:CFSZ 13020序列长度为650 bp，NCBI登录号为MG367260；CFSZ 10356序列长度为690 bp，NCBI登录号为MG367265；CFSZ 10391序列长度为650 bp，NCBI登录号为MG367264；CFSZ13010序列长度为648 bp，登录号为MG367261；CFSZ13005序列长度为660 bp左右，NCBI登录号为MG367262；CFSZ 11366序列长度为664 bp，NCBI登录号为MG367263。

2.3 系统发育分析

对供试样品的ITS序列及相似序列构建系统发育树，结果表明，六个种都聚集在红菇属（Russula）。6个样品的ITS序列系统发育树（图7）。分析结果表明，33个序列聚为两大分支，第一分支包括红菇亚属Subgen.Russula.，包括红菇组sect.Russula和娇弱组sect.Tenellula，其中娇弱组sect.Tenellula只有一个分支美丽亚组 subsect.Puellarinae（R.odorata，R.versicolor，R.nauseosa，R.innocua）。红菇组 sect.Russula分为三个分支非白亚组subsect.Exalbicantinaes（R.exalbicans）、类全缘亚组 subsect.Integrinae（R.depal-lens，R.cavipes，R.subvinosa）、紫罗兰亚组 subsect.Violacinae（R.pelargonia，R.lilacea，R.inocula，R.violacea）。

图7 供试样品及来自Genbank的最相似物种的ITS序列构建的NJ系统发育树

第二分支为异褶亚属（subgen.Heterophyllidia Romagn），该亚属又分为两类:一类为灰色组sect.Griseinae包括 R.aeruginea，R.grisea和 R.atroglauca（CFSZ13020），另一类为异褶组sect.Heterophyllinae包括R.vesca（CFSZ13005），R.mustilina，R.heterophylla。

标本CFSZ 13020和R.atroglauca聚在一起，标本CFSZ 11336与R.odorata聚在一起，CFSZ 13010与R.exabican聚在一起，CFSZ 10391与R.depallens聚在一起，CFSZ 10356和R.pelargonia聚在一起，CFSZ 13005与R.vesca聚在一起，再结合宏观特征和微观结构将CFSZ 13020鉴定为褪绿红菇R.atroglauca，Bootstrap支持率为100%，CFSZ 11336鉴定为香红菇R.odorata，CFSZ 13005鉴定为菱红菇 R.vesca，Bootstrap支持率为99%，CFSZ 13010为非白红菇R.exabican，CFSZ 10391 为 苋 菜 红 菇 R.depallens，CFSZ 10356为佩拉妮娅红菇R.pelargonia，Bootstrap支持率为99%。

3 小结

研究主要参照Sanar（i1998）的分类系统，红菇属分为紧致亚属subgen.Compactae、全缘亚属subgen.Ingratula、美丽红菇亚属 subgen.Amoenula，异褶红菇亚属subgen.Heterophyllidia，壳状红菇亚属subgen.Incrustatula等6个亚属。进化树显示结果与参照的分类系统基本吻合，因此笔者认为该分类系统较为科学。对6种红菇进行了详细的描述，其中2个为中国新记录种，2个为内蒙古新记录种，同时佩拉妮娅R.pelargonia在国内没有描述记录，本文进行了详细描述并配以图片，为该种的鉴定提供了相关借鉴资料，补充了内蒙古甚至我国的菌物资源，为相关菌物资源开发利用提供一定依据。