双孢蘑菇发酵液氨基氮含量测定方法的研究

曾志恒 曾 辉 程 翊 施肖堃 谢神斌 戴建清

（福建省农业科学院食用菌研究所∕特色食用菌繁育与栽培国家地方联合工程研究中心，福建福州350014）

众所周知，氮源对食用菌的生长发育具有重要作用，主要用于合成蛋白质、核酸以及含氮代谢产物[1]。在液体深层发酵过程中，食用菌菌丝体的生长与氮源代谢有密切关系。液体培养基配方中的氮源通常采用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、豆饼粉、麸皮和玉米浆等[2-4]。氨基酸是发酵液中氮源存在主要形式之一，氨基氮是发酵液氨基酸中所含氮的总量，因此可以通过测定发酵液中氨基氮含量变化，掌握氨基氮的变化规律，了解菌丝体对氨基氮的利用情况[5]。据文献报道，氨基氮含量的测定多采用甲醛滴定法[6-7]，但甲醛滴定法测定氨基氮最低检测浓度约为0.4 mg∕mL，因此甲醛滴定法用于测定氨基氮含量高的样品[8]。茚三酮比色法测定氨基氮含量具有灵敏度、准确性高，重现性好等特点被广泛采用[9-10]，但未见其在食用菌发酵液中氨基氮含量测定的应用。笔者建立了茚三酮比色法测定双孢蘑菇发酵培养液氨基氮含量，以期获得可靠的数据，通过掌握液体发酵培养过程中以氨基氮形式存在的氮源代谢规律，为双孢蘑菇液体菌种的生产实践提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株:双孢蘑菇（Agaricus bisporus）W192，由福建省农业科学院食用菌研究所育种室提供。

液体培养基配方:葡萄糖5.00 g∕L，小米粉7.50 g∕L，蛋白胨 2.00 g∕L，黄豆粉 5.00 g∕L，MgSO4·7H2O 0.75 g∕L，KH2PO42.00 g∕L。

主要仪器:UV-1300紫外分光光度计，上海美析仪器有限公司；TGL-16MS冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司；HH-4恒温水浴锅，常州凯航仪器有限公司。

试剂:茚三酮、甘氨酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾，均为分析纯。

1%茚三酮显色剂配制:精确称取1.0 g茚三酮，少量去离子水溶解，100 mL容量瓶定容，摇匀，避光低温保存。

磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液配制:分别将磷酸氢二钠、磷酸二氢钾配制成0.1 mol∕L溶液，将不同体积的磷酸氢二钠、磷酸二氢钾溶液混合，配制成 pH 为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 发酵液供试样品

双孢蘑菇W192菌种活化、摇瓶培养方法见参考文献[2]。发酵液用冷冻高速离心机10 950×g，离心10 min，收集上清液，即得发酵液供试样品，4℃保藏、备用。

1.2.2 测定波长的选择

精密吸取0.3 mL发酵液供试样品于25 mL容量瓶中，补水至0.5 mL，再加入2.0 mLpH为6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液和1.5 mL茚三酮显色剂，混合均匀后，沸水浴中加热30 min后迅速冷却至室温，定容至25 mL后，在500～600 nm，每间隔10 nm波长处，紫外分光光度计测定吸光度，重复3次，吸光度值取平均值。

1.2.3 缓冲液pH的选择

精密吸取0.3 mL发酵液供试样品于25 mL容量瓶中，补水至0.5 mL，再加入2.0 mL pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液和1.5 mL茚三酮显色剂，混合均匀后，沸水浴中加热30 min后迅速冷却至室温，定容至25 mL后，在570 nm波长处测定吸光度，重复3次，吸光度值取平均值。

1.2.4 显示剂用量

精密吸取0.3 mL发酵液供试样品于25 mL容量瓶中，补水至0.5 mL，加入2.0 mL pH为6.5的缓冲液，分别加入0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL茚三酮显色剂，混合均匀后，沸水浴中加热30 min后迅速冷却至室温，定容至25 mL后，在570 nm波长处测定吸光度，重复3次，吸光度值取平均值。

1.2.5 加热时间

才三四个月时间，小小的坟茔上已经长满杂草，枯黄在寒风里；张翔重新将坟挖开，将他母亲的骨灰盒并排放在他父亲的骨灰盒边上，但他突然又改变了主意，将母亲的骨灰盒压在父亲的骨灰盒上。谁叫母亲活着时受够了父亲的气。但人活着的时间总是有限的，而死后的时间才是无限的，他要母亲永远压住父亲，让他永世不得翻身。埋好后，张翔站在坟前抽烟，他为自己的做法得意地大笑，一阵狂笑过后，却早已泪流满面。

精密吸取0.3 mL发酵液供试样品于25 mL容量瓶中，补水至0.5 mL，再加入2.0 mL pH为6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液和1.5 mL茚三酮显色剂，混合均匀后，沸水浴中分别加热10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、40 min后，迅速冷却至室温，定容至25 mL，在570 nm波长下测定吸光度。重复3次，吸光度值取平均值。

1.2.6 氨基氮标准曲线的制作

取甘氨酸置于干燥箱，105℃干燥2 h至恒重，放入干燥器中冷却至室温，精确称取1.25 g甘氨酸，去离子水溶解后100 mL容量瓶定容，配制成12.50 mg∕mL母液，精密吸取1.0 mL甘氨酸母液，25 mL容量瓶定容，配制成0.5 mg∕mL的甘氨酸标准溶液。精密吸取甘氨酸标准溶液0 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL、0.45 mL、0.5 mL，分别置于25 mL容量瓶中，补水至0.5 mL，加入2.0 mL pH为6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液和1.5 mL茚三酮显色剂，混合均匀后，沸水浴加热30 min，迅速流水冷却，定容至25 mL，在570 nm波长下测定吸光度值。以去离子水为空白调零，以甘氨酸质量换算成氨基氮质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.7 样品测定

精密移取不同培养时间的发酵液供试样品0.3 mL于25 mL容量瓶中，补水至0.5 mL，再加入2.0 mL pH为6.5的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液和1.5 mL茚三酮显色剂，混合均匀后，沸水浴中加热30 min，迅速流水冷却，定容至25 mL，以去离子水为空白，于570 nm处测定吸光度，根据标准曲线，计算发酵液中氨基氮的质量。

2 结果与分析

2.1 测定波长的确定

为了确定茚三酮比色法测定发酵液中氨基氮的最佳波长，显色液在波长为500～600 nm进行检测，结果如图1所示，显色液在波长570 nm下，吸光度值最大。因此，确定570 nm作为检测波长。

图1 不同波长的吸光度

2.2 缓冲液pH的确定

据文献报道，茚三酮比色法测定氨基酸受pH影响很大[11]，为了提高检测灵敏度和准确性，反应体系在不同pH条件下进行显色反应，显色液在波长570 nm下，测定吸光度值，结果见图2。从图2中可知，pH在5.0～6.5，随pH的增大，显色液吸光度值逐渐增大；当pH为6.5时，显色液吸光度值达到最大值；pH在6.5～8.0，随pH的增大，显色液吸光度值逐渐减小。由此可见发酵液中氨基酸与茚三酮的显色反应适宜在弱酸的环境中，故确定反应体系加入的缓冲溶液的pH为6.5。

图2 pH对吸光度的影响

2.3 茚三酮显色剂用量的确定

从图3中可以看出，茚三酮显色剂用量在0.5～1.5 mL，随显色剂用量的不断增加，显色液吸光度值逐渐增大；在显色剂用量为1.5 mL时，显色液吸光度值达到最大值；继续增加显色剂用量，显色液的吸光度值缓慢降低。因此，确定质量浓度为1%的茚三酮显色剂用量为1.5 mL。

图3 茚三酮显色剂用量对吸光度的影响

2.4 加热时间的确定

图4 显示了不同沸水浴加热时间对吸光度的影响。由图4可见，加热时间在10～30 min，随加热时间延长，吸光度值缓慢增加；当加热时间为30 min，吸光值达到最大值；继续延长加热时间，吸光值减小，说明30 min为最适加热时间。

图4 加热时间对吸光度的影响

2.5 标准曲线

在上述建立的检测条件基础上，以甘氨酸氨基氮含量为横坐标，吸光度值（OD570）为纵坐标，制作出氨基氮标准曲线如图5所示。标准曲线表明，在测定范围内的氨基氮含量与相应的吸光度值之间呈良好线性关系，其回归方程为:y=48.803x-0.7603，R2=0.999。

图5 氨基氮标准曲线

2.6 方法学考察

2.6.1 精确度试验

取0.3 mL培养10 d的双孢蘑菇发酵液，按照上述建立的检测条件，连续测定6次，记录吸光度值，其吸光度值如表1所示。从表1可以看出，连续6次的测定相对标准偏差RSD为0.434%，说明分光光度计精确度良好。

表1 精确度试验结果

2.6.2 稳定性试验

取0.3 mL培养10 d双孢蘑菇发酵液，按照上述建立的检测条件，显色反应完成后每隔10 min测定1次，结果见表2。由表2可知，显色液在0～1 h内吸光度值波动较小，具有较小的相对标准偏差，RSD=0.648%，说明发酵液经茚三酮显色反应后在1 h内较稳定。

表2 稳定性试验结果

2.6.3 加样回收率

分别于3个三角瓶中取培养12 d双孢蘑菇发酵液0.3 mL，精确加入甘氨酸对照品适量，按上述建立的检测方法测定各样品溶液加样前后氨基氮吸光度值，根据氨基氮标准曲线，计算氨基氮含量、回收率，试验结果见表3。回收率（P）公式为:

式中:n1表示实测量；n2表示样品量；n3表示加样量。

表3 样品加样回收率试验结果

由表3可知，样品溶液氨基氮的平均加样回收率为100.4%，相对标准偏差RSD为1.55%。这表明该方法中氨基氮的回收性良好。

3 小结与讨论

通过测定食用菌发酵液中氨基氮含量变化，可以掌握液体发酵培养过程中以氨基氮形式存在的氮源代谢规律。目前，测定食用菌发酵液中氨基氮含量主要采用甲醛滴定法[6-7]，但甲醛滴定法适合测定氨基氮含量高的样品[8]，并且测量时使用的甲醛对检测人员和环境危害较大；测定氨基氮含量还可以采用双指示剂甲醛滴定法，但滴定终点靠肉眼对颜色的观察来判断，误差较大[12]。笔者首次建立茚三酮比色法测定双孢蘑菇发酵培养液氨基氮含量。该方法具有操作简便、准确、重复性好等优点，可以准确地测定双孢蘑菇发酵培养过程中发酵液的氨基氮含量，为液体菌种的生产实践提供数据支持。