表达视网膜Müller细胞的转基因小鼠基因鉴定△

姚晓倩 方媛 吴继红 李倩 牛亮亮 孙兴怀 陈君毅

(复旦大学附属眼耳鼻喉科医院眼科 上海 200031)

Müller细胞为脊椎动物视网膜最主要的胶质细胞，它几乎贯穿整个视网膜，在解剖结构及功能上，与视网膜各层神经元胞体和突触间有着广泛的联系[1-2]。Müller细胞为视网膜神经细胞再生的主要来源。有研究[3-5]表明，哺乳动物视网膜受损后，其Müller细胞在生长因子或转录因子作用下，可以迅速进入细胞周期，去分化为多潜能的视网膜前体细胞，并进一步分化为视网膜神经细胞。因此，视网膜Müller细胞被认为是眼内一种潜在的视网膜干细胞。CRALBP (cellular retinaldehyde-binding protein)及谷氨酰胺合酶(glutamine synthetase，GS)为标染视网膜Müller细胞的标记物，但是视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial, RPE)也可被CRALBP及GS标染[6]，所以，为保证增殖细胞为视网膜Müller细胞来源，我们选择应用转基因模型。目前，转基因模型在多个领域中发挥了不可估量的作用，包括通过荧光蛋白表达标记特定神经元、敲除或过度表达特定细胞类型的基因以及削弱或抑制特定神经元群体的活性。例如，使用转基因小鼠，在已定义的神经元群中表达相对高水平的荧光标记物，如Thy1-EYFP[7]。

目前研究发现，通过与不同细胞类型特异性Cre系杂交，可以检测标记细胞的形态，追踪轴突投射，记录电生理活动，进行短期和长期的体内成像[8-9]，并跟踪发育和分化[10]。新的Cre报告小鼠已存入JAX小鼠库供分发(JAX小鼠库存编号: Ai2,007920; Ai3,007903; Ai6,007906; Ai9,007909; Ai14,007914)，且到目前为止，最常用产生Cre 报告小鼠的位点是Gt(ROSA)26Sor (Rosa26)位点[11]，因为Rosa26是一个通用的表达位点，并且允许一个外源性强启动子插入其中以驱动更高层次的表达。Rosa26位点通过靶向插入含有强表达CAG启动子的构建物对其进行修饰，随后插入loxP侧(floxed)停止盒控制的荧光标记基因[7]。所以，我们从美国Jackson实验室引进了2种转基因小鼠：Sox2-Cre和Rosa26转基因小鼠，此2种转基因鼠的后代可使视网膜Müller细胞都表达特异荧光。若增殖细胞的荧光可以和其共染，则可确定增殖细胞为Müller细胞来源，即可以追踪到所有的新增殖细胞，进而研究其分化。我们将通过基因鉴定、免疫荧光实验方法选择出可特异性表达视网膜Müller细胞的后代。

1 资料与方法

1.1 实验动物 从美国Jackson实验室引进Sox2-Cre和Rosa26转基因小鼠。饲养动物房室温为20～26 ℃，湿度为40%～70%，光照12 h明暗交替。

1)Sox2-Cre转基因鼠。库存编号：008454。品系名称：B6.Cg-Tg(Sox2-cre)1Amc/J[12]。

Sox2-Cre转基因鼠是一种正常体型、可繁育的健康小鼠，这些转基因小鼠在含有基因2启动子SRY(sex determining region-Y)-box小鼠的控制下表达Cre重组酶。当Sox2-Cre转基因与含有loxP侧序列的小鼠交配时，Cre 重组酶的参与使后代表达Sox2组织的floxed序列缺失，且来源于杂合子转基因雌性鼠的后代均可有Cre重组酶的活动，与其表型无关。这种母系遗传的方式可以提供有效、高速繁育动物的作用机制。

Sox2-Cre转基因由来源于Sox2(包含基因-2的SRY-box)小鼠12.5 kb的上游调节区域、鸡 β-actin 内含子、一个Cre重组酶基因及兔 β-球蛋白 poly A序列组成。这种转基因被引入B6CBAF1供体卵子中，此品系最初与C57BL/6交配，后代再与Swiss Webster小鼠交配，最终再与C57BL/6交配，直到繁育到第11代。

2)Rosa 26转基因鼠。库存编号：007914。品系名称：B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J[13]。

Ai 14 Cre报告基因小鼠携带有Gt(ROSA)26Sor位点的靶向突变，该突变带有一个loxP停止盒，以阻止CAG启动子驱动的红色荧光蛋白变异(tdTomato)的转录。tdTomato是通过Cre介导的重组表达的。

Ai14半合子小鼠对这种Rosa-CAG-LSL-tdTomato-WPRE::deltaNeo条件等位基因是可行的和可育的。一个loxP侧面的停止盒防止下游红色荧光蛋白变异株(tdTomato)的转录。当与表达Cre重组酶的小鼠交配后，所产生的后代在Cre重组酶表达组织中可以删除停止盒，从而促使tdTomato的表达。因为这个CAG启动子驱动的报告结构是有针对性的插入Gt(ROSA)26Sor位点，所以tdTomato的表达由表达Cre重组酶的组织决定。Ai14小鼠在引入Cre重组酶前不会表达tdTomato，引入Cre重组酶后其可以表达tdTomato，并且暴露于Cre后的tdTomato表达有望通过免疫荧光和mRNA检测出。这些Ai14小鼠可用作Cre报告株，经Cre介导重组后表达红色荧光蛋白变异株tdTomato。

1.2 耗材 1.5 mL EP管、载玻片、盖玻片、水浴锅(Pony Science)、高速冷冻离心机 (Thermo Scientific)、聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪(Eppendorf Mastercycler)、移液枪(Eppendorf)、移液枪头、电泳仪(Bio Rad PowerPac)、凝胶成像仪(JS-6800)、冷冻切片机(Leica CM3050 S)、共聚焦显微镜(Leica SP8)。

1.3 试剂 DNA裂解液[DirectPCR (Tail) Lysis Reagent；VIGEN Biotech Inc]、蛋白酶K (Proteinase K)、DNA mix(Takara Code No.R040Q/R040A)、ddH2O、琼脂糖(上海威奥生物科技有限公司)、电泳缓冲液(碧云天)、溴化乙啶、DNA上样缓冲液(TianGen Biotech)、DNA marker(TianGen Biotech)。

封闭液：5%BSA(Shanghai Yeasen Biotechnology)+0.3%Triton X-10(Sigma, T9284)+PBS；稀释液：1%BSA(Shanghai Yeasen Biotechnology)+0.3%Triton X-10(Sigma, T9284)+PBS；一抗：rabbit anti-GS(1∶1 000, Abcam, Boston, MA)；二抗：Alexa FluorTM 488 goat anti-rabbit (1∶200, Invitrogen)；Hoechst 33258 pentahydrate (1∶1 000; Life Technology, Eugene, OR, USA)；抗荧光衰退封片剂(上海威奥生物科技有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 鉴定原理 通过电穿孔(129S6/Sv Ev Tac x C57 BL/6)F1衍生的胚胎干细胞将靶向载体插入Gt(Rosa)26Sor位点的外显子1和2之间。Rosa-CAG-LSL-tdTomato-WPRE靶向载体5′～ 3′端由CMV-IE增强子/鸡-肌动蛋白/兔-球蛋白的混合启动子 (CAG)，一个FRT站点，一个loxP侧的停止盒(所有3个读帧中都有停止密码子和一个三poly A信号)，tdTomato序列 [12个残基与2个拷贝的蛋白(串联二聚体)连接融合的非齐聚Ds红色荧光蛋白变异序列]，土拨鼠肝炎病毒后转录调节元素(WPRE-提高mRNA转录的稳定性)，一个 poly A信号和一个attB/ attp侧的PGK-FRT-Neo-poly A盒组成。我们所选用的Ai 14 Cre报告基因小鼠携带有Gt(ROSA)26Sor位点的靶向突变，该突变带有一个loxP停止盒，以阻止CAG启动子驱动的红色荧光蛋白变异(tdTomato)的转录。当与表达Cre重组酶的小鼠交配后，所产生的后代在Cre重组酶表达的组织中可以删除停止盒，从而促使tdTomato的表达[12-14](图1)。

1.4.2 鉴定方法 剪除刚出生的以上2种转基因小鼠后代的鼠尾2 mm，将鼠尾放入1.5 mL的EP管中，做好标记，加入DNA裂解液(200 μL)+蛋白酶K(4 μL), 放入55 ℃水浴锅孵育过夜。第2天，水浴锅调至85 ℃继续加热45 min，然后放置于高速冷冻离心机，2 000转/min离心2 min。选用DNA mix 10 μL、引物(表1)各0.4 μL，样本1 μL，ddH2O 7.4 μL配置20 μL体系。将配好的体系放入PCR扩增仪，设定基因鉴定所需的循环(表2)行定量PCR。野生型片段约324 bp，因Cre重组酶的引入，删除含loxP位点片段后的片段为250 bp。

图1. tdTomato转基因小鼠鉴定原理示意图

表1 PCR引物序列

表2 PCR程序

注“-”示无此项

1.4.3 冷冻切片及免疫荧光 通过基因鉴定出的转基因小鼠处死后取其眼球，小鼠眼球的固定、脱水、包埋及制作冷冻切片同我们之前的实验方法[15]。选取冷冻切片行免疫荧光，首先室温下冷冻切片应用封闭液封闭1 h，一抗选用Müller细胞的标记物rabbit anti-GS，用稀释液按1∶1 000比例稀释一抗，4 ℃一抗孵育过夜。第2天，切片用PBS清洗4遍(约20 min),孵育二抗，二抗为Alexa FluorTM 488 goat anti-rabbit，用稀释液按 1∶200 稀释二抗，室温孵育2 h，PBS再次清洗4遍后标染细胞核的标记物-Hoechst 33258 pentahydrate，按1∶1 000稀释，标染5 min，清洗4遍，应用抗荧光衰退封片剂封片，共聚焦显微镜扫描图像。

2 结果

2.1 鼠尾DNA的基因型鉴定结果 如果只能扩增到324 bp条带，说明小鼠是野生型；若能得到250 bp和324 bp 2个条带，说明是杂合子小鼠(图 2)。

图2. tdTomato转基因小鼠基因型鉴定结果

2.2 tdTomato转基因小鼠可表达视网膜Müller细胞标记物GS 转基因小鼠视网膜Müller细胞本身自发红色荧光(tdTomato：其在细胞突触及胞体均可检测出)，用GS标记视网膜Müller细胞表达绿色荧光，发现转基因小鼠的红色荧光可以和GS绿色荧光共标染，进一步确定转基因小鼠可表达视网膜Müller细胞(图 3)。

图3. tdTomato与GS共同标染视网膜Müller细胞

3 讨论

转基因动物是指将外源基因用实验方法插入动物生殖细胞的基因组而获得插入基因的特性，并能正常繁衍的动物[16]。随着人类基因组DNA测序完成，特异基因的功能鉴定已成为人类基因组学的首要任务[17]。目前，转基因动物在基因调控机制、致癌作用及神经系统反应等探讨中发挥重要作用[18-22]。因此，在我们的实验中，成功引进Sox2-Cre以及Rosa26转基因小鼠为今后实验确定增殖细胞为视网膜Müller细胞来源提供了可靠的依据。此2种小鼠的杂交后代可以使tdTomato基因表达，且Ai14 Cre报告基因半合子小鼠的稳定性较强，其可以使视网膜Müller细胞的形态在共聚焦显微镜下给人以直观的展示，Müller细胞突触和胞体同时表达特异红色荧光[7]。但是，由于转基因小鼠常采用同系基因小鼠作为正常对照，转基因小鼠和与之相对应的正常小鼠从外观上很难区分，因此，转基因小鼠基因型的鉴定为后续功能实验开始的首要任务[17]。

本实验采用传统DNA提取、PCR扩增及电泳等方法成功鉴定出可特异表达tdTomato基因的转基因小鼠后代，并通过免疫荧光方法进一步证明表达tdTomato特异荧光的细胞为Müller细胞。转基因小鼠模型的成功构建及鉴定提高了我们今后实验结果的准确性，也为致盲性眼病的研究提供了重要依据。

志谢与声明：此项实验由我们实验人员独立完成，同时感谢动物房辛勤付出的老师和工作人员。所有动物实验步骤均遵循动物管理委员会规则，并严格遵循动物在眼科及视力研究中的有关声明。