电感耦合等离子体质谱法结合模式识别的生/制何首乌无机元素差异研究

林艳　夏伯候　李春　廖端芳　林丽美　刘月新

摘要：目的  建立生/制何首烏无机元素的电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）分析方法，并采用模式识别对两者进行鉴别。方法  采用ICP-MS测定22批不同产地生/制何首乌无机元素，并用Simca13.0软件对数据进行主成分分析和正交偏最小二乘-判别分析。结果  22批不同产地生/制何首乌共检出镁（Mg）、钾（K）、铁（Fe）、钒（V）、钴（Co）、锰（Mn）、镍（Ni）、锶（Sr）、铷（Rb）、钡（Ba）、砷（As）、铅（Pb）、铬（Cr）、铜（Cu）14种无机元素，其中常量元素以K、Fe、Mg含量较为丰富，微量元素以Mn、Ni、Sr、Rb、Ba含量较为丰富。主成分分析不能将生/制何首乌完全分开，正交偏最小二乘-判别分析能将生/制何首乌基本分开;Cu、Cr、Ni、Mg为生/制何首乌最主要的差异性无机元素，其中Cu（VIP=2.2）对生/制何首乌的差异贡献最大。结论  本研究成功采用ICP-MS从无机元素角度区分了生/制何首乌，可为中药材质量控制提供参考。

关键词：电感耦合等离子体质谱;生何首乌;制何首乌;无机元素;模式识别;铜

中图分类号：R284.1    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）09-0069-04

Study on Differences of Inorganic Elements Between Crude and Processed Polygonui Multiflori Radix Using ICP-MS and Pattern Recognition

LIN Yan^1，2， XIA Bohou^1，2， LI Chun^2，3， LIAO Duanfang^1，2， LIN Limei^1，2， LIU Yuexin^1，2

1. College of Pharmacy， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China; 2. Key Laboratory for Quality Evaluation of Bulk Herbs of Hunan Province， Changsha 410208， China; 3. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China

    Abstract： Objective To study the differences of inorganic elements between crude and processed Polygonui Multiflori Radix by ICP-MS; To use pattern recognition to identify the two. Methods The inorganic elements in 22 batches of crude and processed Polygonui Multiflori Radix were determinated by ICP-MS， which were analyzed by PCA and OPLS-DA of Simca13.0 software. Results There were 14 common inorganic elements in the 22 batches of crude and processed Polygonui Multiflori Radix， which were Mg， K， Fe， V， Co， Mn， Ni， Sr， Rb， Ba， As， Pb， Cr and Cu. The contents of K， Fe， and Mg were abundant in the macro element， and Mn， Ni， Sr， Rb， Ba were abundant in the micro element. These samples could not be completely divided into two categories by PCA， but they could be divided into two categories by OPLS-DA. Cu， Cr， Ni， and Mg were identified as the main different inorganic element， in which Cu （VIP=2.2） was the most different inorganic element. Conclusion The study can successfully identify the crude and processed Polygonui Multiflori Radix by ICP-MS， and can provide reference for quality control of TCM.

    Keywords： ICP-MS; crude Polygonui Multiflori Radix; processed Polygonui Multiflori Radix; inorganic elements; pattern recognition; Cu

何首乌为蓼科植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根。生何首乌苦泄性平兼发散，具有解毒消痈、润肠通便、截疟功效;制何首乌味甘厚性温，具有补肝肾、益精血、乌须发和强筋骨功效^[1]。药理研究表明，何首乌具有抗衰老、提高免疫力、抗动脉粥样硬化等作用，毒理作用主要表现为肝毒性^[2-3]。何首乌主要含有二苯乙烯苷、蒽醌、鞣质等活性成分，另外，何首乌中无机元素对药效和毒性的影响也不能忽视。无机元素测定方法主要有原子荧光法、原子吸收分光光度法和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）等^[4]。ICP-MS具有灵敏度高、分析速度快等优点，已在中药无机元素的分析测定中推广^[5-6]。现有的何首乌无机元素研究局限于无机元素含量的测定，而对生/制何首乌所含无机元素的差异性研究鲜有报道。因此，本研究建立不同产地生/制何首乌无机元素的ICP-MS检测方法，结合模式识别对测定结果进行分析，为何首乌鉴别和质量控制提供依据。

1  仪器与试药

Agilent 8800三重四极杆ICP-MS仪（Agilent Technologies），101-3A型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司），CP114电子分析天平（上海奥豪斯仪器有限公司），0.22 μm微孔滤膜（上海安谱实验科技股份有限公司），RT-04A型高速粉碎机（香港泓荃制药机械公司），P60-CW国之源超纯水机（科尔顿水务有限公司）。

70%过氧化氢（优级纯，批号20161103），硝酸（优级纯，批号20171016），国药集团化学试剂有限公司;含有镁（Mg）、钾（K）、铁（Fe）、钒（V）、钴（Co）、锰（Mn）、镍（Ni）、锶（Sr）、铷（Rb）、钡（Ba）、砷（As）、铅（Pb）、铬（Cr）、铜（Cu）的多元素标准溶液（10 μg/mL）为国家标准品，安捷伦科技有限公司;市售22批何首乌饮片均经湖南中医药大学药学院中药鉴定教研室龚力民副教授鉴定为蓼科何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根，样品来源信息见表1。

2  方法与结果

2.1  测定条件

工作参数：功率1000 W，冷却气流量15.6 L/min，辅助气流量0.85 L/min，载气流量0.92 L/min，样品提升量1.0 L/min，采样深度10 mm，采样锥孔径1.1 mm，截取锥孔径0.89 mm。

测量参数：停留时间30 ms，重复次数3，测量点/峰3，测量循环次数10，样品分析时间70 s/个，测量方式为标准曲线法，读数方式为峰强。

2.2  供试品溶液制备

取样品粉末（过4号筛）约0.5 g，精密称定，置于聚四氟乙烯消解灌中，加入HNO₃-H₂O₂（4∶1）溶液15 mL，盖上坩埚盖，置于通风橱中静置过夜，次日于可控温电热板上60～80 ℃进行湿法消解，加热至溶液透明澄清，冷却至室温，于通风橱挥尽酸，用超纯水定容至50 mL，摇匀，即得。

2.3  对照品溶液制备

取一定量10 μg/mL多元素标准溶液，用1%HNO₃溶液逐级稀释，得到多元素浓度分别为0.001、0.004、0.016、0.064、0.256、1.024、4.096 μg/mL的对照品溶液，用于含量测定。

2.4  标准曲线制备

取14种无机元素的系列浓度对照品溶液，按测定条件依次测定，以对照品浓度为横坐标，对照品峰强度为纵坐标，绘制标准曲线，得各元素的回归方程、相关系数和线性范围，结果见表2。

2.5  加样回收率试验

取同一批何首乌饮片粉末（S9）样品6份，每份0.25 g，精密称定，按样品中各元素测定量的100%加入相应对照品，分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液，进行含量测定，计算加样回收率，各无机元素的平均回收率为98.12%～102.45%，RSD均小于1.4%。

2.6  样品含量测定

取各样品供试品溶液，按上述条件测定，结果见表3。22批样品中常量元素K、Fe、Mg含量较为丰富，微量元素以Mn、Ni、Sr、Rb、Ba含量较为丰富。

2.7  化學模式识别

2.7.1  主成分分析

采用主成分分析（PCA）对22批何首乌样品建模，将数据导入Simca13.0软件，以共有无机元素含量为自变量，以不同批次何首乌为因变量，进行聚类分析。从PCA得分图（图1A）可见，此方法不能将22批生/制何首乌完全分开。

2.7.2  正交偏最小二乘-判别分析

为了更好建立生/制何首乌无机元素的差异模型，运用正交偏最小二乘-判别分析（OPLS-DA）继续分析，结果能将生/制何首乌分成2类（见图1B）。根据变量在项目中的重要性（VIP值）筛选差异代谢物，并利用SPSS17.0统计软件进行t检验，以VIP>1及P<0.05确定差异代谢物，发现Cu、Cr、Ni、Mg为生/制何首乌最主要的差异性成分，其中Cu（VIP=2.2）对生/制何首乌的差异性贡献最大（见图1C）。

3  讨论

本试验对样品提取溶剂硝酸、高氯酸、硝酸-过氧化氢（4∶1、2∶1、1∶1）进行了详细考察，确定了样品处理方法和ICP-MS条件，在此条件下提取的无机元素最多。

本试验采用ICP-MS分析了不同产地22批何首乌样品中13种无机元素。结果显示，K、Fe、Mg等常量元素的含量较丰富，微量元素以Mn、Ni、Sr、Rb、Ba含量较为丰富。K能加强肌肉的韧性和心脏的运动力，促进蛋白质、碳水化合物和热能代谢，是人体重要的电解质;Fe参与血红蛋白、肌红蛋白及多种含铁酶的合成，对免疫系统有一定影响;Mg在蛋白质和核酸合成，细胞氧化磷酸化、细胞膜的离子转运等新陈代谢中有重要作用，还与神经和免疫信息传导有关;Mn是人体必需微量元素，参与多种酶的合成与激活，参与机体糖、脂肪的代谢，加快蛋白质、维生素合成，参与造血过程，调节内分泌，提高超氧化物歧化酶活性，提高机体免疫功能。上述元素所表现出的生理功能与何首乌具有免疫调节、抗氧化、抗衰老、抗动脉粥样硬化等作用相一致，说明何首乌的无机元素是重要的功效物质。

重金属及有害元素是中药安全性评价的重要指标，《药用植物及制剂进出口绿色行业标准》限量标准规定Cu≤20.0 μg/g、Pb≤5.0 μg/g、As≤2.0 μg/g^[7]。本研究测定的22批何首乌样品Cu均符合标准，S11、S20的Pb超标，S11、S16、S19、S20的As超标。为确保临床用药安全，重金属及有害金属限量控制应引起足够重视。

计算机模式识别技术是一种有效研究高维空间的手段，能将高维空间的样本进行点分布，利用数学模型降维，对样本点进行比较、判别及预报等研究，进而讨论变量间的关系。中药无机元素与药效存在一定关系，选用合适的元素为特征参量对各类中药进行识别，其平均准确率>85%，可用于中药分类和道地药材鉴别^[8]。应用模式识别研究中药功效和微量元素的关系，表明无机元素含量是中药功效的物质基础之一，每一类药物中微量元素总体水平相近^[9]。本研究通过模式识别分析，建立了生/制何首乌的分类模型，并确定Cu是生/制何首乌中最主要的差异性元素。制何首乌Cu含量明显高于生何首乌，同时，制何首乌的抗衰老、增强免疫和抗动脉粥样硬化等功能明显强于生何首乌^[10-12]，表明无机元素含量与中药功效有关。Cu参与微生素合成，为超氧化物歧化酶活性中心，对机体新陈代谢起促进和协调作用，能增强人体免疫功能，提高白细胞杀菌能力^[13]。Cu参与赖氨酸氧化酶的合成，参与弹性蛋白和胶原蛋白的合成，弹性蛋白和胶原蛋白的质和量影响血管系统尤其是大动脉管壁的完整性;缺Cu时，赖氨酸氧化酶作用减弱，弹性蛋白和胶原纤维发生降解，血管壁内膜受损，血管脆性增加、弹性降低，从而引发动脉粥样硬化^[14]。缺Cu会导致贫血，能量代谢异常，可表现出神经系统症状（如铜缺乏综合征等）;导致毛发色素脱失，机体易出血和凝血时间延长^[15]。ICP-MS结合模式识别可有效地区分生/制何首乌，可为何首乌的质量控制提供新的参考方法，并为中药质量控制提供范例。

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