复方参鹿颗粒干预钙结合蛋白S100A8/A9改善较低危骨髓增生异常综合征患者无效造血机制研究

瞿玮颖　邱仲川　陈珮　黄中迪　胡晓莹　朱小勤　陆颖佳　谈栩铖　赵琳

摘要：目的  观察复方参鹿颗粒对较低危骨髓增生异常综合征（MDS）患者钙结合蛋白S100A8、S100A9的影响，探讨其改善无效造血的作用机制。方法  采用随机数字表法将60例较低危MDS患者分为治疗组和对照组各30例。治疗组予复方参鹿颗粒，每次1包，每日3次，口服;对照组予十一酸睾酮胶丸，每次40 mg，每日3次，口服。2组均连续治疗3个月。比较2组临床疗效，观察2组治疗前后外周血细胞计数、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、血管内皮生长因子（VEGF），钙结合蛋白S100A9、S100A8、S100A8/A9和p-p38蛋白表达及其相关性。结果  治疗组总有效率为85.7%（24/28），对照组为71.4%（20/28），2组比较差异无统计学意义（P>0.05）。与本组治疗前比较，2组治疗后红细胞、血红蛋白、血小板计数明显升高（P<0.05，P<0.01）。与本组治疗前比较，治疗组治疗后TNF-α、IFN-γ、VEGF水平明显下降（P<0.01）;2组治疗后比较，治疗组TNF-α、IFN-γ明显低于对照组（P<0.05，P<0.01）。与正常组比较，2组治疗前S100A8、S100A9、S100A8/A9水平明显升高（P<0.01），p-p38蛋白表达明显增加（P<0.05，P<0.01）;与本组治疗前比较，治疗组治疗后S100A8、S100A9、S100A8/A9水平明显下降（P<0.01），p-p38蛋白表达明显降低（P<0.01）。2组治疗前S100A8、S100A9、S100A8/A9与TNF-α、IFN-γ、VEGF、p-p38蛋白表达呈正相关（P<0.01）。治疗组治疗后S100A8、S100A9、S100A8/A9与总有效率、红细胞、血红蛋白呈正相关（P<0.01）。结论  复方参鹿颗粒可有效改善较低危MDS患者无效造血，其机制可能与下调S100A8、S100A9、S100A8/A9活性，抑制p-p38表达，减少细胞因子分泌有关。

关键词：复方参鹿颗粒;骨髓增生异常综合征;S100A8;S100A9;S100A8/A9;磷酸化p38

中圖分类号：R259.513    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）09-0020-05

Study on Mechanism of Intervention of Compound Shenlu Granules in S100A8/A9 for Improving Ineffective Hematopoiesis in Patients with Lower-risk Myelodysplastic Syndrome

QU Weiying， QIU Zhongchuan， CHEN Pei， HUANG Zhongdi， HU Xiaoying， ZHU Xiaoqin， LU Yingjia， TAN Xucheng， ZHAO Lin

Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine， Shanghai 200021， China

Abstract： Objective To observe the effects of Compound Shenlu Granules on calcium binding protein S100A8 and S100A9 in patients with lower-risk myelodysplastic syndromes （MDS）; To explore its mechanism of improving ineffective hematopoiesis. Methods Totally 60 lower-risk MDS patients were divided into treatment group and control group according to random number table method， with 30 cases in each group. Treatment group was given Compound Shenlu Granules， 1 pack each time， three times a day， orally; while control group was given andriol capsule， 40 mg each time， three times a day， orally. The treatment for both groups lasted for 3 months. Clinical efficacy， blood cell counts， changes of cytokines such as TNF-α， IFN-γ， VEGF， calcium-binding proteins S100A8， S100A9， S100A8/A9， and p-p38 protein expression levels before and after treatment in the two groups and their correlation were observed. Results The total effective rate was 85.7% （24/28） in the treatment group and 71.4% （20/28） in the control group， without statistical difference in the two groups （P>0.05）. Compared with before treatment， the erythrocyte，hemoglobin and platelet counts of the two groups significantly increased after treatment （P<0.05， P<0.01）. Compared with before treatment， the levels of TNF-α， IFN-γ and VEGF in the treatment group decreased significantly （P<0.01）; After treatment， the TNF-α and IFN-γ in the treatment group were significantly lower than those in the control group （P<0.05， P<0.01）. Compared with the normal group， the concentrations of S100A8， S100A9， and S100A8/A9 significantly increased in the two groups before treatment （P<0.01）， and the expression of p-p38 protein significantly increased （P<0.05， P<0.01）. The expressions of S100A8， S100A9 and S100A8/A9 were positively correlated with the expressions of TNF-α， IFN-γ， VEGF and p-p38 （P<0.01） in both groups before treatment. S100A8， S100A9 and S100A8/A9 were positively correlated with total effective rate， red blood cells and hemoglobin （P<0.01） in the treatment group after treatment. Conclusion Compound Shenlu Granules can effectively improve the ineffective hematopoiesis in lower-risk MDS patients. The mechanism may be related to down-regulate the activity of S100A8， S100A9 and S100A8/A9， inhibit the expression of p-p38， and reduce the secretion of inflammatory cytokines.

Keywords： CompoundShenluGranules; myelodysplastic syndromes; S100A8; S100A9; S100A8/A9; p-p38

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes， MDS）是一组异质性克隆性疾病，以无效造血、进展性的外周血细胞减少、高风险向急性髓系白血病转化及总体生存率低为临床特征^[1]。其中70%的患者以无效造血、难治性血细胞减少为主要临床表现的较低危MDS。目前西医学仍缺乏有效治疗手段。S100A8、S100A9是钙结合蛋白S100蛋白家族中的重要成员，近年研究表明，S100A8、S100A9在较低危MDS患者中表达明显升高，可能激活炎症信号转导通路，诱导细胞因子表达，从而引起造血功能障碍，导致骨髓无效造血的发生^[2-3]。复方参鹿颗粒为本院血液科院内制剂（沪药制字Z06100005），临床应用20余年。前期临床研究发现，复方参鹿颗粒可减少MDS造血抑制因子的产生^[4]，下调p-p38蛋白表达从而减少CD34⁺细胞凋亡^[5]。本研究拟进一步证实S100A8/A9表达与细胞因子、p38MAPK通路活化、骨髓无效造血间的关系，探讨复方参鹿颗粒改善较低危MDS骨髓无效造血的作用机制。现报道如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

选择2016年1月-2017年12月本院血液科较低危MDS患者60例，采用随机数字表法分为治疗组和对照组各30例。治疗组男16例，女14例;年龄26～78岁，平均年龄（50.9±14.6）岁;难治性贫血伴环形铁粒幼细胞增多（RARS）1例，难治性中性粒细胞减少（RN）2例，难治性血细胞减少伴多系发育异常（RCMD）27例;国际预后评分系统（IPSS）0.5分26例，1分4例。对照组男17例，女13例;年龄20～79岁，平均年龄（54.2±15.6）岁;RARS 1例，RN 1例，RCMD 28例;IPSS 0.5分25例，1分5例。2组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。治疗组疾病进展为急性髓细胞白血病1例，失访1例;对照组失访2例。选择本院骨科股骨骨折患者8例为正常组，经知情同意后采集其手术时的骨髓液备检。正常组男5例，女3例;年龄30～68岁，平均年龄（50.2±13.7）岁。本研究经本院伦理委员会审查批准（2014-124）。

1.2  西医诊断标准

MDS诊断参照维也纳诊断标准，参照2008年世界卫生组织分型诊断标准制定RARS、RN、RCMD标准^[6]。参照MDS IPSS积分判断预后，IPSS 0.5～1分为中危-1（Int-1），即较低危。

1.3  中医辨证标准

参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》^[7]制定肾阳虚证辨证标准。主症：周身乏力，形寒肢冷，面色、口唇、指甲苍白。次症：头晕，腰膝酸软，大便溏。舌脉：舌质淡，脉沉细或虚大。符合主症及2项以上次症，结合舌脉即可辨证。

1.4  纳入标准

①符合上述诊断标准、分型标准及中医辨证标准;②IPSS≤1分;③半年内未用其他任何可能对造血功能有影响的药物;④年龄18～80岁;⑤患者对本研究知情，并签署知情同意书。

1.5  排除标准

①有明显兼夹证或合并证者;②妊娠期或哺乳期妇女，过敏体质及对本药过敏者;③合并严重的心、脑、肝、肾疾病及精神病患者。

1.6  脫落及剔除标准

①受试者因故未完成本方案规定疗程及观察周期;②病例选择违反纳入标准;③随机化后无数据。

1.7  治疗方法

2组予支持治疗：血红蛋白（Hb）<60 g/L予悬浮红细胞输注;血小板（PLT）<5.0×10⁹/L（无出血危险因子）或PLT<20.0×10⁹/L（有明显出血倾向，或存在出血危险因子）予单采血小板输注及对症止血治疗;合并感染及时予抗感染治疗。

治疗组在支持治疗基础上予复方参鹿颗粒，药物组成：红参须20 g、鹿角片10 g、炙龟甲10 g、熟地黄10 g、菟丝子10 g等，本院制剂室制备（批号20161209、20170302，12 g/包），每次1包，每日3次，口服。对照组在支持治疗基础上予十一酸睾酮胶丸（南京欧加农制药有限公司，批号175526），每次40 mg，每日3次，口服。2组均连续治疗3个月。

1.8  观察指标

1.8.1  外周血细胞计数

每2周采用COULTERLH750型全自动血细胞分析仪检测外周血计数。

1.8.2  细胞因子和钙结合蛋白S100A

于治疗前后空腹采集2组患者外周血各2 mL，2000 r/min离心20 min，采集上清液，ELISA检测TNF-α、IFN-γ、VEGF、S100A9、S100A8、S100A8/A9水平，严格按照试剂盒（德国西门子公司）说明书操作。

1.8.3  p-p38蛋白

Western blot检测p-p38蛋白。2组于治疗前后分别取肝素抗凝骨髓液5 mL，淋巴细胞分离液分离骨髓单个核细胞（BMMNC），收集细胞，BCA法蛋白定量，分离，凝固，加样，蛋白电泳转移，用3%BSA-TBST稀释一抗，室温孵育10 min，4 ℃过夜。次日TBST洗膜5次，加入辣根过氧化酶标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，室温轻摇40 min，ECL显色，曝光，洗片。分别以GAPDH为内参蛋白，用Quantity One分析各蛋白条带灰度值。实验重复3次，取平均值。

1.9  疗效标准

参照《血液病诊断及疗效标准》^[8]制定疗效标准。基本缓解：贫血和出血症状消失，白细胞≥4×10⁹/L，PLT≥100×10⁹/L，Hb≥120 g/L（男）或110 g/L（女），治疗期间无复发。部分缓解：贫血和出血症状消失，白细胞计数≥3.5×10⁹/L，PLT增加，Hb≥120 g/L（男）或110 g/L（女），随访3个月病情持续改善。进步：Hb较治疗前增加30 g/L以上3个月，贫血和出血症状明显好转。无效：症状、血象未达进步。基本缓解、部分缓解、进步归为有效。总有效率（%）=有效例数÷总例数×100%。

1.10  统计学方法

采用SPSS19.0统计软件进行分析。正态分布的计量资料用x（—）±s表示，采用t检验;不服从正态分布或方差不齐采用非参数秩和检验。计数资料采用百分率表示，组间比较采用卡方检验。采用Pearson分析进行相关性分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2  结果

2.1  2组临床疗效比较

治疗组总有效率为85.7%（24/28），对照组为71.4%（20/28），2组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2  2组治疗前后外周血细胞计数比较

与本组治疗前比较，2组治疗后红细胞、Hb、PLT明显上升（P<0.05，P<0.01）;2组治疗后比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

2.3  2组治疗前后细胞因子比较

与本组治疗前比较，2组治疗后TNF-α、IFN-γ、VEGF水平明显下降（P<0.05，P<0.01）;2组治疗后TNF-α、IFN-γ水平比较差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。见表3。

2.4  3组不同时点钙结合蛋白比较

与正常组比较，治疗组和对照组治疗前S100A8、S100A9、S100A8/A9水平明显升高（P<0.01）。与本组治疗前比较，治疗组S100A8、S100A9、S100A8/A9浓度明显降低（P<0.01），治疗组和对照组治疗后比较差异无统计学意义（P>0.05），但仍高于正常组（P<0.01）。见表4。

2.5  3组不同时点p-p38蛋白表达比较

与正常组比较，2组p-p38蛋白表达明显升高（P<0.05，P<0.01）;与本组治疗前比较，治疗组p-p38蛋白表达明显降低（P<0.01）。见表5、图1。

2.6  2组治疗前后钙结合蛋白的相关性分析

2组治疗前S100A8、S100A9、S100A8/A9蛋白表达与细胞因子TNF-α、IFN-γ、VEGF及p-p38蛋白表达呈正相关（P<0.01），见表6。治疗组治疗后S100A8、S100A9、S100A8/A9蛋白与总有效率、红细胞、血红蛋白呈正相关。见表7。

3  讨论

MDS早期以无效造血为主要特征，其发病机制包括肿瘤克隆、炎性骨髓微环境、固有免疫异常等多种因素，其中TNF-α、IFN-γ、VEGF等异常高表达引起骨髓微环境改变及基质免疫调节异常，可导致骨髓造血细胞的过度凋亡^[9]。

S100A8、S100A9是钙结合蛋白S100蛋白家族中重要成员，是固有免疫系统最重要的病原模式受体之一TLR4的内源性配体。二者可以钙离子依赖性方式形成异源二聚体蛋白复合物S100A8/A9发挥作用，参与炎症反应、调节细胞生长分化、生长抑制、诱导细胞凋亡等^[10]。有研究发现，S100A8/A9在较低危MDS患者中显著增加，并通过诱导分泌TNF-α等炎性因子导致促红细胞生成素的表达受抑^[11]。S100A9转基因小鼠可表现出与MDS患者一样的骨髓的病态造血^[2]。另有研究表明，克隆性造血常见的基因突变可直接导致炎症状态的启动，并可通过S100A8/A9诱导固有免疫系统异常激活，建立炎性环境，在抑制正常造血的同时使突变克隆获得进一步的优势扩张^[12-13]。提示S100A8/A9可能为MDS基因异常、固有免疫异常活化和骨髓无效造血三者间重要的分子联系。本研究中2例MDS-RARS患者（SF3B1基因EXON15突变），其S100A9浓度均超过20 ng/mL，显著高于无体细胞基因突变患者。较低危MDS患者骨髓造血细胞存在p38组成性激活，使细胞内p-p38表达升高，异常活化的p38可直接导致骨髓CD34⁺细胞的过度凋亡^[14]，p38是S100A8/A9-TLR4信号通路的下游^[15]。2组治疗前外周血中S100A8、S100A9、S100A8/A9较正常组明显增加，且与TNF-α、IFN-γ、VEGF及p-p38蛋白表达呈正相关，提示异常表达的S100A8、S100A9、S100A8/A9可能通过激活p38 MAPK信号途径，进而放大促炎因子应答，导致骨髓无效造血。

MDS属中医学“虚劳”“血证”“髓毒劳”等范畴，其本质为正虚邪实，治当扶正虚祛邪毒。较低危MDS患者临床表现以贫血症状多见，症见面色萎黄或带晦黯，倦怠纳减，心悸头晕，腰脊酸软，苔薄白，舌淡，脉沉细弱。病机属脏腑虚损，元气虚弱，治当以补虚为主。《素问·至真要大论篇》有“虚者补之”“勞者温之”，《素问·阴阳应象大论篇》云：“因其衰而彰之”，“形不足者，温之以气;精不足者，补之以味。”可见对于虚劳诸证，温补乃是第一要法。《灵枢·经脉》载：“人始生，先成精，精成而脑髓生，骨为干，脉为营……血气乃成”，可见血气之成始于精，而肾藏五脏六腑之精气，主骨生髓，肾中阳气乃血液生化之原动力。因此，本病病机当肾阳虚衰为本，治疗当温肾益髓，补益气血。