针刺对多囊卵巢综合征痰湿证患者血清代谢组分的影响机制研究

李修阳　张宁　任健　徐琬梨　李毓秋　陈宇

摘要：目的  探索針刺对多囊卵巢综合征（PCOS）痰湿证患者血清代谢组分影响的作用机制。方法  采用随机数字表法将PCOS痰湿证患者分为针刺组和西药组各20例。针刺组予针灸治疗，每日1次，周末及经期暂停;西药组予炔雌醇环丙孕酮片，每日1片，口服，自月经来潮或撤退性出血第5日起连续治疗21 d。2组均连续治疗3个月。观察2组治疗前后卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、睾酮（T）水平，比较LH/FSH、体质量指数（BMI）;检测2组治疗前后血清内源性小分子代谢物，比较2组代谢图谱差异，分析针刺对患者血清小分子代谢物的影响，确定其与人体生化代谢通路异常的内在联系。结果  与本组治疗前比较，2组治疗后FSH、LH、T、LH/FSH、BMI明显改善（P<0.05）;2组治疗后比较，针刺组BMI优于西药组（P<0.05）。2组均对酮类合成降解、生物素代谢、赖氨酸合成降解等代谢通路产生影响，针刺组对PCOS痰湿证生物标志物柠檬酸及其上游糖代谢相关小分子代谢物所在通路影响更为显著。结论  针刺可能通过影响柠檬酸循环改善糖酵解和糖异生，恢复PCOS痰湿证患者的能量代谢。

关键词：针刺;多囊卵巢综合征;血清;代谢组分;机制研究

中图分类号：R271.917.51    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）09-0015-05

Study on Mechanism of Effects of Acupuncture on Serum Metabolic Components of Phlegm-dampness Type of Polycystic Ovary Syndrome

LI Xiuyang¹， ZHANG Ning²， REN Jian¹， XU Wanli¹， LI Yuqiu¹， CHEN Yu¹

1. Shandong University of TCM， Jinan 250355， China;2. Affiliated Hospital of Shandong University of TCM， Jinan 250011， China

Abstract： Objective To explore the mechanism of acupuncture on serum metabolic components of phlegm-dampness type of polycystic ovary syndrome （PCOS）. Methods Patients with phlegm-dampness type of PCOS were divided into acupuncture group and Western medicine group according to random number table method， with 20 patients in each group. Acupuncture group was treated with acupuncture， once a day， resting during weekends and menstrual periods; Western medicine group was treated with ethinylestradiol cyproterone tablets， one tablet a day， orally， taking 21 days from the 5th day of menstrual cramps （or withdrawal bleeding）. Treatment for both groups lasted for three months. The levels of follicle stimulating hormone （FSH）， luteinizing hormone （LH） and testosterone （T） were observed before and after treatment. The LH/FSH and body mass index （BMI） were compared. The serum endogenous small molecule metabolites of the two groups were detected before and after treatment. The differences of metabolic profiles were compared. The effects of acupuncture on serum small molecule metabolites were analyzed to determine its intrinsic link with abnormalities of human biochemical metabolic pathways. Results Compared with before treatment， the FSH， LH， T， LH/FSH and BMI of the two groups were significantly improved （P<0.05）. After treatment， BMI in the acupuncture group was better than that in the Western medicine group （P<0.05）. Both groups had effects on metabolic pathways such as ketone synthesis degradation， biotin metabolism，lysine synthesis and degradation. But acupuncture group had a more significant effect on the pathway of biomarker citric acid of phlegm-dampness type of PCOS and its upstream sugar metabolism-related small molecule metabolites. Conclusion Acupuncture may improve glycolysis and gluconeogenesis by affecting the citric acid cycle， and restore the energy metabolism of phlegm-dampness type of PCOS.

Keywords： acupuncture; polycystic ovary syndrome; serum; metabolic components; mechanism study

多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是育龄期女性最为多见的内分泌紊乱疾病，是引发不排卵性不孕的主要因素，在不排卵性不孕中的发病率为50%～70%^[1]。西医治疗本病主要采用激素对抗疗法，促排卵药纠正不排卵和多囊样改变，但易引发卵巢过度刺激征、子宫内膜增生等不良反应^[2]。针刺疗法可明显改善PCOS患者内分泌异常和排卵障碍^[3]，但作用机制复杂。本课题组前期筛选出PCOS痰湿证常见的9种血清生物标志物^[4]。本研究通过对比针刺与常规西药对患者血清常见生物标志物的影响，阐释针刺治疗PCOS可能的作用机制。现报道如下。

1  资料与方法

1.1  一般资料

选择2017年10月-2018年8月山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与遗传中心的住院与门诊患者40例，采用随机数字表法分为针刺组和西药组各20例。针刺组平均年龄（32.25±1.66）岁，平均病程（4.12±1.19）年;西药组平均年龄（29.94±2.92）岁，平均病程（3.98±1.32）年。2组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经山东中医药大学附属医院伦理委员会审查批准[（2017）临床科研申报第（048）号]。

1.2  西医诊断标准

参照美国生殖医学协会与欧洲人类生殖协会共同认定的鹿特丹标准^[5]制定PCOS诊断标准。①偶发排卵和/或无排卵;②临床和/或生化指标提示存在高雄激素血症（HA），并排除先天性肾上腺增生、分泌雄激素肿瘤和库欣综合征等。HA临床表现为痤疮、多毛、秃顶，生化指标强调游离睾酮的意义;③双侧卵巢多囊性改变：双侧卵巢见12个及以上直径2～9 mm小卵泡，和/或单侧卵巢体积>10 cm³。以上①～③项具备任意2项即可诊断。

1.3  中医辨证标准

参照《中药新药临床研究指导原则（试行）》^[6]、《中医妇科学》^[7]制定痰湿证辨证标准。①周期延后，经量少，经色淡红，质黏腻如痰，或逐渐闭经，或婚久不孕;②胸腹痞满;③易恶心呕吐;④形体肥胖或四肢倦怠，神疲乏力;⑤白带多而黏腻;⑥舌淡胖或有齿印，苔腻;⑦脉滑。以上①必备，兼见其余3项即可辨证。

1.4  纳入标准

①符合上述西医诊断标准及中医辨证标准;②近3个月未服用可能对生殖内分泌及代谢功能有影响的药物;③患者对本研究知情，并签署知情同意书。

1.5  排除标准

①伴内分泌功能异常，如肾上腺皮质增生症、肾上腺皮质功能减退、甲状腺功能亢进、甲状腺功能低下、垂体肿瘤、糖尿病;②伴肝、肾、心脑血管系统疾病者;③伴血液病、急性生殖泌尿系统炎症及神经、精神性疾病者;④生殖器官器质性病变、生殖系统肿瘤者;⑤近3个月内服用激素类药物或避孕药者;⑥生理性月经后期及闭经者;⑦依从性较差者。

1.6  治疗方法

针刺组：取三阴交、关元、子宫、中极、气海、阴陵泉、丰隆、肾俞、太溪，除氣海、关元、中极外均取双侧，阴陵泉、三阴交、丰隆先泻后补^[8-9]，每日1次，留针30 min，10 min行针1次，每周5次，周末和经期暂停。西药组予炔雌醇环丙孕酮片（拜耳医药保健有限公司广州分公司，批号280A，2 mg∶0.035 mg/片），每日1片，口服，自月经来潮或撤退性出血第5日起连续服用21 d。2组均治疗3个月。

1.7  观察指标

1.7.1  激素水平及体质量指数

于治疗前后2组患者早卵泡期（月经3～4 d）或闭经期（B超下无优势卵泡）抽取空腹静脉血5 mL，3000 r/min离心10 min取血清，-80 ℃保存备用。检测2组患者卵泡刺激素（FSH）、黄体生成素（LH）、睾酮（T）水平，比较LH/FSH。测量患者体质量、身高，计算体质量指数（BMI）。

1.7.2  代谢组学标本检测

检测分为NMR数据采集、数据处理和代谢物的筛选与鉴定三部分。数据处理采用无监督的模式识别方法和有监督的模式识别方法结合方式，无监督模式识别方法采用主成分分析法（PCA），有监督模式识别方法引入正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA），将正交信号校正法（OSC）与偏最小二乘法（PLS）结合，以提高模式识别方法的判断能力。通过OPLS-DA和各代谢物相对应的相关系数，筛选出有统计意义的差异代谢物，通过差异代谢物映射的通路，找到与代谢物差异相关性最高的代谢通路。

2  结果

2.1  2组治疗前后激素水平、体质量指数比较

与本组治疗前比较，2组治疗后T、LH、FSH水平及LH/FSH、BMI明显改善（P<0.05）。2组治疗后比较，西药组T、LH、FSH水平及LH/FSH优于针刺组（P<0.05），针刺组BMI指数优于西药组（P<0.05），见表1。

2.2  主成分分析

PCA是将一组观测的可能相关变量，通过正交变换转换为线性不相关变量（即主成分）的统计方法，可揭示数据内部结构，从而更好地解释数据变量，有效地利用少量的主成分使数据的维度降低。针刺组和西药组血清样本PCA得分散点图见图1、图2。可见治疗前后2组代谢成分可显著分开，说明2组治疗均会导致样本代谢物水平发生一定程度变化。

2.3  2组治疗前后代谢物正交偏最小二乘法-判别分析及模型验证结果

基于核磁共振平台代谢组学数据具有较高维（检测出一些代谢物）、小样本（检测样本量偏少）的特性，若采用PCA模型或PLS模型分析，由于相关变量的影响，差异变量会分散到更多的主成分上，无法进行更好的可视化和后续分析，故采用OPLS-DA，筛掉代谢物中与分类变量无关的正交变量，分别分析非正交变量和正交变量，得出更可靠的差异代谢物及相关程度信息。使用SIMCA-P+11.0软件对数据进行UV格式化处理，先对主成分行OPLS-DA建模分析，模型质量用7折血清交叉验证检验;再用交叉验证后得出的R2Y（Y变量的可解释变量）和Q2（可预测性）对模型有效性进行评价;最后应用置换检验，多次随机变换变量Y的排序得出不一样的随机Q2值，对其有效性做出较好查验。见图3、图4。从2组OPLS-DA散点图可见，治疗前后样本可进一步区分开。同时，下方的置换检验图中两条虚线斜率均大于0，说明2组OPLS-DA模型拟合情况较好，不存在过拟合现象，稳定性强，可较好地用于后续结果预测。

2.4  2组治疗前后差异代谢物载荷图及其相关代谢通路

对2组治疗前后OPLS-DA及各代谢物相应的相关系数分析。将每一个变量的Loading值與其标准偏差的平方根值相乘后进行数据回溯转换。与相应的相关系数临界值表进行比对，得到引起治疗前后差异的代谢物，并在载荷图中重点标注。结果显示，2组治疗前后血清代谢成分差异均有统计学意义（P<0.05）。针刺组治疗后呈明显上调趋势的代谢物有柠檬酸、3-羟基丁酸、甘油磷酸胆碱、低密度脂蛋白L1、极低密度脂蛋白L2、脂质L6、脂质L9、α-葡萄糖、β-葡萄糖、赖氨酸、苏氨酸。西药组治疗后呈显著上调趋势的代谢物有3-羟基丁酸、低密度脂蛋白L3、脂质L8、脂质L9、赖氨酸。见图5、图6。

通过对差异代谢物所在通路的综合分析（包括富集分析和拓扑分析）和筛选，找到与代谢物差异相关性最高的关键通路。其中，与2组均相关的代谢通路有酮类合成降解通路、生物素代谢、赖氨酸合成降解通路、氨酰基-tRNA生物合成等，但针刺区别于西药的差异代谢通路主要表现为柠檬酸循环通路和糖酵解、糖异生通路，改变的代谢物主要集中在柠檬酸循环的上游。代谢通路分析的结果见图7、图8。

3  讨论

PCOS属中医学“闭经”“不孕”等范畴。其发病与脾、肝、肾三脏功能失调关系密切，痰湿证是最常见证型，痰壅胞宫是PCOS基本病机^[10]。痰湿属阴邪，易伤阳气，痰湿停聚阻滞经络气血正常运行，使胞宫正常功能受到影响，能量代谢功能紊乱，最终导致月经失调，难以受精成孕。国外研究显示，PCOS患者存在柠檬酸循环障碍^[11]。柠檬酸循环是人体能量代谢的枢纽，其循环障碍会导致能量代谢紊乱，可伴随出现多种机体供能不足的表现，这些表现与痰湿证表现基本一致。PCOS痰湿证患者体内伴随柠檬酸循环障碍，HA可通过减少柠檬酸水平影响柠檬酸循环，这也是胰岛素抵抗存在的重要证据^[12]。研究发现，外源性补充柠檬酸能够调节高脂血症小鼠的血脂水平，并能改善高脂血症小鼠对胰岛素的敏感性^[13]。

针灸治疗PCOS主要在于调整人体的内分泌状态，促使性激素的分泌和排卵功能恢复正常。三阴交为足三阴经交会穴，可理血调经、健脾摄血、补肝益肾;阴陵泉为脾经合穴、治湿要穴，两穴合用能治水湿诸证。丰隆为祛痰要穴，是胃经络穴，与脾经穴位合用，共奏健脾和胃、燥湿化痰之功。太溪为肾经原穴，与肾俞合用，可益气填精，恢复肾阳的气化作用，调节水湿代谢，恢复月经。气海、关元、中极为任脉要穴，能健运中焦、固肾培元，三穴合用可增强元气，通调水道。子宫为经外奇穴，主治月经不调，痰湿壅滞。上述诸穴并用，可调节人体气血阴阳平衡，运化痰湿，恢复人体的正常能量代谢。本研究显示，针刺改善患者内分泌激素效果不如西药显著，但改善BMI优势明显，这可能与针刺改善痰湿状态、调节能量代谢有关。针刺和西药均能显著改变PCOS痰湿证的血清代谢组分，主要涉及的代谢通路也多有重合。本研究显示，柠檬酸在针刺影响下显著改变，提示针刺可通过改善人体能量代谢紊乱，调整人体的内分泌机能。同时，针刺能明显上调血清中葡萄糖及生糖氨基酸苏氨酸水平，说明针刺对PCOS痰湿证的糖酵解增强和糖异生抑制状态起到良性调节作用。作为胆碱酯酶抑制剂，甘油磷酸胆碱活性抑制后可使乙酰胆碱与其受体结合，诱导胰岛素分泌，加重胰岛素抵抗，血清中甘油磷酸胆碱在针刺后上调，说明针刺可能通过增强甘油磷酸胆碱活性，加快乙酰胆碱的代谢速率，以减轻高胰岛素血症。

综上所述，本研究显示针刺可能通过影响柠檬酸循环及上游小分子代谢物来改善糖酵解和糖异生，降低胰岛素抵抗，恢复PCOS患者能量代谢。这可能是针刺区别于西药治疗的作用机制，也可能是针刺整体改善PCOS痰湿证患者代谢指标的依据。今后将继续扩大样本量，进一步筛选关键的差异代谢物，从分子水平上明确针刺治疗干预PCOS痰湿证的作用机制。

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