实验小鼠、大鼠微卫星DNA检测法标准的编制

王 洪，魏 杰，冯育芳，付 瑞，王淑菁，岳秉飞

(中国食品药品检定研究院，北京 102629)

实验动物遗传质量是决定科研数据可重复性的关键因素，我国目前急需在该领域建立分子生物学方法，实现对实验动物遗传质量的有效控制。结合实际工作需求，中国实验动物学会提出了小鼠、大鼠微卫星DNA标记检测方法团体标准的研究和建立，由中国食品药品检定研究院、首都医科大学和浙江省医学科学院共同完成。本文重点介绍了该标准编制的背景和标准内容，旨在强化该团体标准的宣传和实施，促进我国实验动物遗传质量标准化建设，为实验动物遗传质量国家标准的修订提供依据。

1 编制背景

实验动物遗传质量控制是实验动物质量控制中的关键环节。生物医学研究中必须使用遗传背景明确，符合其品系遗传特征的实验动物，才能获得可信的，可重复的科研数据。在我国，实验动物的遗传质量控制主要应用国家标准GB/T 14927.1-2008中推荐的生化标记检测法，该方法自上世纪90年代投入使用，一直沿用至今，该方法在实验动物遗传质量控制方面发挥着至关重要的作用。在国际上，越来越多的实验室应用微卫星标记，SNP标记等DNA标记方法进行实验动物的遗传质量检测。在美国，Jackson Lab 采用SNP方法(28个位点)作为实验动物的遗传质量控制手段[1]。我国国家标准GB 14923-2010 哺乳类实验 动物的遗传质量控制中也对封闭群实验动物的遗传质量监测提出明确规定，并推荐使用DNA标记方法。

目前，我国实验动物遗传质量控制方面急需解决的问题主要是：①现行的生化标记检测法存在一定的局限性：位点数量少，位点多态性低，位点未能实现全基因组覆盖，完成检测需要处死实验动物；②DNA标记方法在我国实验动物遗传质量控制方面的应用尚属空白；③缺少DNA检测方法的标准。

微卫星DNA是动物基因组中的简单重复序列，该重复序列比小卫星DNA短，所以叫作微卫星DNA(microsatellite DNA)。微卫星DNA的核心序列是以二个核苷酸为重复单位，AC和TG最为多见，核心序列的重复次数是可变的，一般为10 ～ 20次左右，这就是微卫星DNA多态性的基础。不同个体因为核心序列重复次数的差异，而形成各自特有的遗传结构。微卫星DNA两端的侧翼序列是相对保守的单拷贝序列，可以根据两侧的特异序列合成引物。微卫星DNA标记可以应用于实验小鼠和实验大鼠进行遗传质量监测，同时开展遗传组成分析和品系鉴别。在国家标准GB/T 14927.1-2008近交系小鼠、大鼠生化标记检测法中，是生化标记方法的具体操作内容，目前国内缺乏DNA标记方法相应标准。本标准参考了我国、美国、日本等国家的微卫星DNA标记检测法[2-7]，本标准的编制可以作为国家标准GB 14927.1-2008的补充。

2 内容编制

2.1 微卫星位点的选择

微卫星方法和SNP方法均可用于实验小鼠和实验大鼠的遗传质量评价的常用的DNA标记方法。SNP方法检测实验动物单核苷酸的差异，能够提供的动物的遗传背景信息不如微卫星方法丰富。微卫星方法的优点是：数量多，在基因组中均匀分布；具有丰富的多态性；操作简便，重复性好[8]。本标准中的微卫星位点的选择参考国内外相关文献，切合我国国内实际现状，并可持续完善。标准中选用的微卫星位点经过严格的筛选和优化。优化原则包括：①选择多态性丰富的位点，摒弃在多个品系间无多态性的位点；②选择覆盖实验小鼠和实验大鼠的全部染色体的微卫星位点，力求全面客观体现动物品系的遗传背景；③选择电泳条带清晰，界限明确，杂带少的位点，减少非特异性扩增对检测结果的影响。该标准中的微卫星检测法经过广东、浙江和北京的三家实验室对其重复性进行验证，结果表明三家实验室获得完全一致的检测结果，证明该方法具备可行性和良好的重复性。通过参加国际实验动物科学理事会(International Council for Laboratory Animal Science，ICLAS)开展的遗传标准品项目(Genetic Reference Program)，应用12个品系近交系小鼠的DNA标准品完成对微卫星检测法的适用性研究。结果表明，该标准方法是国际通用的实验动物遗传质量评价方法。标准中采用30个小鼠微卫星位点用于近交系小鼠的遗传质量检测和封闭群小鼠的群体遗传结构分析，具体位点信息见表1。标准中采用6个大鼠的微卫星位点用于近交系大鼠的遗传质量检测，采用25个大鼠的微卫星位点用于封闭群大鼠的群体遗传结构分析，具体位点信息见表2和表3。

2.2 近交系小鼠和近交系大鼠遗传质量评价

近交系实验动物是指经过20代以上连续全同胞或亲子交配，近交系数达到98.6%以上的动物群体。近交系动物同一品系中不同个体的遗传背景完全相同，所有遗传标记都是纯合的。近交系小鼠的品系数量多，每一个品系拥有自身特有的遗传背景。当进行近交系小鼠的遗传质量检测时，应根据检测目的选取微卫星位点，如果仅用于区别少数近交系小鼠，可选择10个微卫星位点；如果待检测近交系品系数量多，可选择20个微卫星位点。原则上需选取覆盖小鼠20条染色体的20个微卫星位点。参见表4所示7个近交系小鼠品系的遗传背景。

近交系大鼠的品系数量较少，用表2中的6个微卫星标记，可以区分常见的3个品系的近交系大鼠。

结果判定：近交系小鼠和近交系大鼠同一品系的所有个体在所有微卫星位点均应表现为纯合，该品系即为遗传质量合格的实验动物。如果同一品系内出现杂合位点，该品系即为遗传质量不合格的实验动物。

表1 实验小鼠30个微卫星位点的扩增条件和染色体分布

表2 近交系大鼠6个微卫星引物序列及常见品系带型

注：按泳动快慢将条带按a、b、c依次命名，泳动最快的条带命名为“a”。

Note. The name of the bands (a, b, c) indicates the band migration speed; the fastest band is named ‘a’.

表3 封闭群大鼠25个微卫星位点序列和染色体分布

(续表3)

位点Locus引物序列(5’→3’)Primer sequences染色体ChromosomeLCATACAGAGCAAGCTCCAGGACTGTTTCTAATCCATAGGAAGTGC13ALBTTTTCGTAGTAACGGAAGCCTAAGGATTCTCAGATGCAAATG14D15Mit3GACCTGACCTGTTGTGGGATGTTGCTCTCTGGCCTCCTC15MBPAACCTACACGGACACATGGTGGTTGTACTTCCTGATTTCCCTTT16ACRMAGGAAATTAAGAGAAGTTGGGACTTATGCTCTTTGGGCAGCTTA17TILPAATCACTGGATGCTGGAAGAAGGGAGCAGAACTACTAAAGATACA18AGTTATGTAACTCAACGCCAGCCTAAGGATTCTCAGATGCAAATG19TNFAGGAAATGGGTTTCAGTTCCCAGGATTCTGTGGCAATCTG20PRPS2GTTTTCCCGCTTCACCAGAGAAGGAGAAAGCGACCGX

表4 常见近交系小鼠在30个微卫星位点的片段大小

2.3 封闭群小鼠和封闭群大鼠群体遗传质量评价

不同类型的实验动物有独特的遗传检测需求。必须选择适当的遗传质量检测方式。与近交系实验动物不同，封闭群实验动物同一品系不同个体具有多样化的基因型，所有遗传标记都是杂合的。对于近交系动物，可以对一个个体进行遗传质量检测；对于封闭群动物，至少应采用25只动物进行检测，才能获得相对准确的检测结果。而微卫星位点的选择，封闭群小鼠在表1中选择25个微卫星位点，原则上需覆盖小鼠的20条染色体。封闭群大鼠选取表3中25个微卫星位点进行扩增，原则上需覆盖大鼠的21条染色体。通过提取DNA，PCR反应，电泳和测序获取检测数据，应用软件POPGEN 1.32和PIC_CALC 0.6对数据进行分析处理。获取能够体现封闭群群体遗传多样性特征的指标。

封闭群实验动物群体的遗传结构，通过群体的平均杂合度，群体的多态信息含量和哈代-温伯格(Hardy-Weinberg)平衡来体现。如果群体的平均杂合度在0.5～0.7时，群体为合格的封闭群群体；如果群体的平均杂合度小于0.5时，认为该群体趋于近交；如果群体的平均杂合度在大于0.7时，认为该群体趋于野生。遗传多样性分析采用国际上通用的多态性信息量(polymorphism information content，PIC)。PIC是指一个标记依靠其可检测的等位基因数和它们的分布频率，从而得到该标记在一个群体中检测的多态性大小值[9]。PIC值的大小在0 ～ 1之间，0表示无多态性，1表示具有非常高的多态性。PIC > 0.5为高度多态性；0.25 < PIC < 0.5为中度多态性；PIC < 0.25为低度多态性[10]。亦可以利用哈代-温伯格(Hardy-Weinberg)定律判断封闭群实验动物群体的遗传质量合格与否。群体内一个位点上的基因型频率和基因频率保持不变，处于遗传平衡状态，这一平衡状态就称之为Hardy-Weinberg平衡。经过软件分析可以获知群体在微卫星位点是否处于Hardy-Weinberg平衡。平衡即判定为遗传质量合格，不平衡即判定为遗传质量不合格。

3 应用前景

近交系动物微卫星位点的选取不一定拘泥于20个微卫星位点，可根据需要灵活调整。如果仅用于区分两个品系的近交系小鼠，选取10个微卫星位点即可满足需求。初次应用微卫星方法获得的近交系小鼠的遗传数据可以作为该品系后续遗传质量检测的依据。封闭群的动物进行群体遗传结构分析时，应采用基础群实验动物，动物的数量不应小于25只。动物数量少和非基础群的动物获得的数据将对分析结果带来偏差。

生物医学的发展离不开实验动物，实验动物的发展离不开质量控制。实验动物的遗传质量是所有质量控制的基础。团体标准T/CALAS 21-2017小鼠、大鼠微卫星DNA标记检测方法的建立弥补了现行国家标准中生化标记检测法的局限性，微卫星方法的位点数量多且多态性丰富，位点实现了全基因组覆盖[11]。微卫星方法最突出的优点是，仅需要提取少量血液样本的DNA即可实现实验动物的遗传质量检测，无需安乐死实验动物，符合动物福利和3R原则[11]。标准的制定表明我国的实验动物遗传质量控制手段迈上了一个新台阶，并且逐步与国际水平接轨，有利于我国实验动物质量整体水平的提升。