一个复方中药处方对流感病毒A/PR/8/H1N1感染小鼠肺损伤的影响
2019-09-27王学文朱祥宇李永清
王学文,朱祥宇,李永清
(1.中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所,北京 102629; 2.北京大学人民医院动物实验室,北京 100044; 3.北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京 100097)
流行性感冒简称为流感,是一种急性呼吸道传染病,它是由流感病毒引起的。流感病毒感染为急性感染,主要由呼吸道侵入机体,在呼吸道的细胞内复制增殖,引起细胞变性坏死和脱落,进而影响到支气管、细支气管、肺泡及支气管其周围组织,甚至引起肺泡壁充血水肿、渗出液和纤维蛋白增加以及中性粒细胞和单核细胞的浸润等[1-2]。肺作为流感病毒的靶器官,药物能否抑制流感病毒在靶器官中复制是衡量抗病毒药效的指标之一[3]。
某些中药具有抑制病毒的复制、阻止病毒引起细胞病变、调节机体免疫功能、改善肺循环和镇痛抗炎等综合功效,且病毒难以对其产生抗药性,因此筛选安全有效的中药一直是防治甲型流感病毒感染的研究热点。实验选用的复方中药是北京洪天力药业有限公司提供临床经验方,由蒲公英、百部、白薇、白术等多味中药组方而成的复方中药,是针对解热镇痛、抗病毒、抗感染、抗氧化和调节免疫功能而组方[4-8]。
本实验通过流感病毒A/PR/8/H1N1感染小鼠成功建立模型后,观察该复方中药对流感病毒A/PR/8/H1N1感染小鼠所致肺损伤的影响,为复方中药抗流感病毒的临床应用提供科学依据。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
SPF级BALB/c小鼠,雌性90只,6 ~ 8周龄,体重18 ~ 22 g,购于北京大学医学部实验动物科学部[SCXK (京) 2011-0012]。取回后饲养于北京市农林科学院畜牧兽医研究所隔离器中[SYXK (京) 2012-0034]。动物实验过程中,根据实验动物使用的3R原则给予人道关怀。实验设计符合福利伦理要求,实验动物福利伦利审批号:20150316-3。
1.1.2 病毒毒株
H1N1鼠肺流感适应株A/Puerto Rico/8/1934(以下简称PR8),有中国农业大学刘金华老师馈赠。
1.2 主要试剂与仪器
复方中药(北京洪天力药业有限公司提供临床经验方);盐酸金刚烷胺(美国Sigma公司);甲醛溶液(天津市福晨化学试剂厂);95%和100%乙醇、二甲苯、伊红、苏木素、盐酸分析纯AR级(北京化学试剂公司)。
BHC-1300IIA2生物安全柜(苏州安泰空气技术有限公司);DW-HL828 -80℃冰箱(中科美菱低温科技有限责任公司);5810R台式冷冻离心机(Eppendorf公司);Nikon E200光学显微镜(日本尼康公司);KD-BM生物组织包埋机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司);RM2016轮转石蜡切片机(德国徕卡公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 试剂配制
PR8先经鸡胚传代增殖两轮,过滤4℃保存备用,然后测LD50为10-3.375/50 μL。所有病毒均为-80℃保存备用。
复方中药实验前用100℃去离子水配制成需要的浓度。
盐酸金刚烷胺,含量98%以上,用蒸馏水配制成浓度为10 mg/mL药液。
1%鸡血红细胞悬液:将SPF级成年公鸡翅下静脉取血,分离红细胞,用生理盐水制成体积分数为1%的悬液,置于4℃保存备用。
1.3.2 实验动物分组及模型的建立
将90只雌性BALB/c小鼠,适应性喂养5 d后,称重后随机分为6组,每组15只,每笼5只。6组分别为空白对照组,病毒对照组,盐酸金刚烷胺对照组,复方中药高、中、低剂量组。分组及灌胃剂量见表1。
表1 BALB/c小鼠实验分组
中药组连续灌胃2 d后,BALB/c小鼠镇静麻醉。空白对照组每只滴鼻PBS 50 μL,其他各组滴鼻攻毒流感病毒PR8 10 LD50/50 μL。病毒感染4 h后,中药三个剂量组经灌胃给药,连续灌胃5 d,每天一次,0.2 mL/10 g;空白对照组和模型对照组灌胃生理盐水,组盐酸金刚烷胺组灌胃金刚烷胺药液,灌胃体积、时间和方式同中药三个剂量组。
1.3.3 肺指数计算
病毒感染5 d后,禁食不禁水过夜12 h,称重取血后处死,打开胸腔并摘取全肺称重,计算肺指数和肺指数抑制率:
肺指数=(小鼠肺重/小鼠体重) × 100%;
肺指数抑制率=(病毒对照组平均肺指数 - 实验组平均肺指数)/病毒对照组平均肺指数 × 100%。
1.3.4 肺组织匀浆悬液的病毒血凝效价
各组随机取6个肺置于匀浆器中加冷生理盐水[肺重(g)/生理盐水(mL)=1/9],在冰浴中研磨制成匀浆,4℃离心后取上清做微量血凝实验。
1.3.5 肺组织形态学观察
BALB/c小鼠死亡后,各组取6只BALB/c小鼠肺,将迅速摘取的肺放入10%的福尔马林中固定,常规切片,HE染色,光镜下观察组织病理变化。
1.4 统计学方法
2 结果
2.1 复方中药对流感病毒PR8感染小鼠肺指数的影响
流感病毒PR8感染小鼠后,连续灌胃5 d后肺指数的变化结果显示:与空白对照组相比,病毒对照组肺指数显著升高(P< 0.01);与病毒对照组相比,金刚烷胺组和中药中剂量组肺指数显著降低(P< 0.01),中药低剂量组和中药高剂量组肺指数显著降低(P< 0.05)。结果见由表2。
2.2 复方中药对流感病毒PR8在感染小鼠肺组织中血凝滴度的影响
利用红血球凝集实验(HA)测定PR8感染小鼠后在肺组织中的血凝效价,反映流感病毒的复制情况。连续灌胃5 d后,与病毒对照组相比,药物组小鼠肺组织血凝滴度均显著降低(P< 0.01),表明各组药物对流感病毒均有不同程度的抑制效果,盐酸金刚烷胺组血凝滴度最低,抑制流感病毒效果最好。复方中药各药物组血凝滴度中剂量组低于高剂量组和低剂量组,说明三个剂量组中,复方中药中剂量组抗流感病毒组效果更好。结果见表3。
2.3 复方中药对流感病毒PR8感染小鼠肺组织的病理形态学影响
复方中药对于PR8感染小鼠5 d后病理形态学结果显示:HE染色观察正常组小鼠肺组织结构,终末细支气管部分向周边伸展,构成呼吸细支气管,再分支成肺泡管(腺泡)和肺泡,各级支气管结构清楚,肺泡组织内基本没有浸润的炎性细胞,渗出。肺泡壁毛细血管充满红细胞。各级支气管周围间质有肺动脉、肺静脉、淋巴组织和疏松结缔组织(图1A)。
表2 复方中药对流感病毒PR8感染BALB/c小鼠肺指数和肺指数抑制率的影响
注:病毒对照组与空白对照组相比,ΔΔP< 0.01;各药物组与病毒对照组相比,*P< 0.05,**P< 0.01。
Note. The virus control group compared with the normal control group,ΔΔP< 0.01. Each drug treatment group compared with the virus control group,*P< 0.05,**P< 0.01.
表3 复方中药对流感病毒PR8感染BALB/c小鼠肺组织中血凝滴度的影响
注:与病毒对照组相比,**P< 0.01。
Note. Compared with the virus control group,**P< 0.01.
注:A:空白对照组;B:病毒对照组;C:金刚烷胺组;D:复方中药中剂量组;E:复方中药高剂量组;F:复方中药低剂量组。图1 复方中药对PR8感染BALB/c小鼠肺组织的病理形态学的影响Note. A, Normal group. B, Virus control group. C, Amantadine group. D, Medium dose compound traditional Chinese medicine group. E, High dose compound traditional Chinese medicine group. F, Low dose compound traditional Chinese medicine group.Figure 1 Effect of the Chinese medicine prescription on the pathology of lung tissues in the PR8-infected BALB/c mice
病毒对照组大部分肺组织肺泡结构破坏,部分肺组织实变区融合,肺泡隔增厚,肺泡腔和间质内炎细胞浸润,病变较重,毛细血管充血(图1B,箭头b)肺泡破坏,炎性细胞浸润(图1B,箭头a)。盐酸金刚烷胺组连续7 d灌胃,可明显改善肺部炎性病变程度,炎细胞浸润明显减少或消退,接近正常肺组织结构(图1C,箭头)。
复方中药不同剂量组连续灌胃7 d后,不同程度的改善了肺组织的病变,由切片照片可以看出中剂量组约1/2肺组织炎性细胞明显减少,未见充血出血(图1D,箭头)。低剂量治疗后效果约1/3肺组织炎性细胞明显减少,其余的肺组织炎细胞减少(图1F,箭头)。高剂量组约1/3肺组织炎性细胞明显减少,抑制作用不如中剂量组明显(图1E,箭头)。
3 讨论
流感病毒感染小鼠致肺损伤后,肺淤血水肿,体积变大,且重量增加,而体重往往减轻。肺指数是指小鼠肺重占体重的百分比[9]。表明肺组织病度越严重,肺重量越大,肺指数相对越大[10-12]。解剖观察到肺叶有淤血、红肿或坏死灶。药物治疗后,肺部淤血水肿可能减轻或者消失,肺指数相对减小。因此肺指数和肺叶大体外观变化从宏观上反映了肺部病变的程度。
实验结果表明,流感病毒感染BALB/c小鼠后第5天,与病毒对照组相比,空白对照组、盐酸金刚烷胺组小鼠肺指数显著升高(P< 0.01),说明模型和阳性对照都是成立的。病毒对照组解剖肺,看到肺严重淤血水肿,病灶累及2个或以上肺叶。复方中药中剂量组灌胃7 d后,与病毒对照组相比,肺指数显著下降(P< 0.01),高剂量组和低剂量组肺指数亦显著下降(P< 0.05),说明复方中药三个剂量组均有抗炎抗病毒作用,可降低流感病毒感染小鼠的肺指数。结合肺组织病理学分析,空白对照组肺结构未见改变,肺泡大小正常,细支气管粘膜完整,管腔内无分泌物。病毒对照组显微镜下观察肺部病变明显,正常的肺组织结构形态消失,肺泡间隔增厚,肺泡壁和细支气管壁大量炎性细胞浸润,肺泡腔内浆液性渗出。流感病毒所致的小鼠肺炎病理改变为典型的间质性肺炎表现,与报道[13-15]结果一致。感染小鼠继续灌胃经复方中药和盐酸金刚烷胺治疗后,肺部病理改变均有一定的改善,炎性细胞减少,肺组织形态有所恢复,这可能是灌胃给予复方中药和盐酸金刚烷胺后,提高小鼠死亡保护率,生存时间延长的直接原因。
红细胞凝集实验(HA)是利用流感病毒与人、豚鼠和鸡的红细胞发生凝集的实验,其原理是流感病毒粒表面的血凝素(HA)蛋白,可以识别和结合哺乳动物和禽类的红细胞表面受体,病毒被吸附到红细胞上而相互发生凝集。HA效价可作为衡量流感病毒含量的一个指标。本实验结果显示,流感病毒攻毒组小鼠肺组织病毒血凝效价最高,说明在感染流感病毒后第5天,流感病毒在肺组织中已大量繁殖。与此同时,盐酸金刚烷胺对照组和复方中药各组血凝滴度均显著降低(P< 0.01),表明盐酸金刚烷胺组及复方中药各剂量组均可不同程度的降低流感病毒感染小鼠的肺组织病毒血凝滴度,即不同程度的抑制流感病毒的复制。
综上所述,肺指数和肺叶病理形态学从宏观和微观上反映了肺部病变的严重程度及评价药物的治疗效果,而肺组织病毒血凝滴度反应了流感病毒在肺部的增殖程度。本实验复方中药治疗流感病毒感染的小鼠后,平均肺指数和平均血凝滴度降低,并且肺部组织病理形态有了明显改善。表明复方中药通过抑制流感病毒在肺内的增殖,来减轻流感病毒导致的肺损伤,从而改善了肺功能。