FOXO3A对全身照射小鼠造血系统辐射损伤的影响

王玉全，李程程，苏路路，管博文，卢延华，关菲菲，荣 利，王小春，孟爱民*，樊飞跃

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所，北京协和医学院比较医学中心，国家卫生健康委员会人类疾病比较医学重点实验室，北京市人类重大疾病实验动物模型工程技术研究中心，北京 100021； 2.北京市化工职业病防治院，北京市职业病防治研究院，北京 100093)

医疗诊断和治疗中电离辐射(ionizing radiation，IR)手段应用增多、核能生产、太空活动增加，给人类带来巨大的利益与帮助。同时，人类对IR暴露机会增多，可能对人类健康产生损害[1-3]。机体的造血系统对IR最为敏感，短期的高剂量辐射暴露和长期的低剂量辐射暴露均能引起造血系统辐射损伤，IR对造血系统的损伤主要表现为两方面：急性骨髓抑制和长期骨髓抑制。急性骨髓抑制临床上表现为外周血细胞计数降低，容易引发急性感染或死亡，主要是由IR引起造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells，HPCs)和少量造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)的凋亡[4]，可以给予造血细胞生长因子(hematopoietic growth factors，HGFs)治疗以缓解症状[5]，但是也会影响HSCs功能，加重HSCs功能损伤[6]；长期骨髓抑制临床表现为再生障碍贫血，甚至诱发白血病，是IR远期辐射损伤的主要表现，同时也是临床上进行肿瘤放化疗治疗时出现的严重毒副作用之一[4]，主要是由于IR引起大量HSCs凋亡、衰老，导致骨髓衰竭[7-8]。长期骨髓抑制具有迟发性，临床治疗上容易被忽视，目前尚无有效治疗手段，死亡率较高[1]。由此，造血系统辐射损伤防护与治疗方法的研究一直是人们关注的热点。

IR诱导的氧化应激是造血细胞辐射损伤的重要机制，IR诱导的造血细胞及其微环境中活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生增加，促进HPCs、HSCs凋亡，HSCs分化异常导致造血细胞数量减少，诱导HSCs衰老导致其自我更新能力下降，损伤骨髓基质细胞导致造血干细胞龛稳态紊乱，最终导致骨髓抑制，骨髓衰竭[8-10]。生理情况下，机体细胞存在有效的ROS清除机制。叉头状转录因子O亚族3(forkhead box transcription factor O 3，FOXO3/FOXO3A)在氧化应激调节上发挥重要作用，ROS可以诱导FOXO3A转录激活，促进抗氧化酶系基因的表达上调，清除ROS，减轻氧化应激损伤。前期研究发现FOXO3A转录因子在HSCs稳态调节上发挥重要作用[11]，FOXO3A基因敲除小鼠表现HSCs自我更新能力的丧失和过早衰竭[12]。同时，FOXO3A可以通过调节毛细血管扩张性共济失调突变(ataxia telangiectasia mutated，ATM)基因和抗氧化酶系的表达调节HSCs中ROS水平，维持HSCs功能[13]。范科尼贫血蛋白2(Fanconi anemia protein 2，Fancd2)基因介导的DNA损伤修复通路与FOXO3A基因介导的应激调节通路在HSCs维持上存在功能性协同调节作用[14]。我们前期研究发现全身照射(total body irradiation，TBI)小鼠给以抗氧化剂白藜芦醇治疗，可以抑制辐射诱导骨髓HSCs ROS合成增加，阻止辐射诱导的HSCs衰老，缓解辐射诱导的长期损伤[13]。而白藜芦醇对HSCs辐射损伤的缓解作用可能是诱导去乙酰化酶Sirt1激活FOXO3A调节[15-16]。这提示FOXO3A在抗氧化应激调节缓解造血细胞辐射损伤中发挥重要作用。进一步研究FOXO3A在造血细胞辐射损伤中的作用及机制可以为造血系统辐射损伤的诊断治疗提供资料。由此我们拟利用FOXO3A基因敲除小鼠模型来探讨FOXO3A对全身照射小鼠造血系统辐射损伤的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

FVB品系SPF级FOXO3A基因敲除小鼠(FOXO3A-/-)及野生型小鼠(FOXO3A+/+，WT)，于中国医学科学院医学实验动物研究所SPF级屏障环境动物房[SYXK (京) 2015-0035]中自行繁育鉴定[17]，雄性，体重25～30 g，8～12周龄。实验方案通过中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会(IACUC)审批，IACUC号为：MAM17002。实验过程中，在不影响实验要求和实验结果的基础上，严格按实验动物使用的3R原则关注实验动物福利。

1.2 主要试剂与仪器

EDTA-K3购自Sigma公司；甲基纤维素培养基购自Stem cell Technologies公司；流式抗体CD4、CD8、B220、Ter119、Gr-1、CD11b、streptavidin、scal-1、ckit均购自BD Bioscience和eBioscience公司。X-RAD 225高能量生物学X射线辐照仪(美国)；FACS AriaTMⅡ流式细胞仪(BD Bioscience)；DX120全自动血液分析仪(ABX Pentra)；CKX41倒置显微镜(奥林帕斯)。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠分组和照射

小鼠均分为四组(每组3～6只)：野生型小鼠对照组(WT组)，FOXO3A-/-小鼠对照组(FOXO3A-/-组)，野生型小鼠照射组(WT+IR)，FOXO3A-/-小鼠照射组(FOXO3A-/-+IR)，对照组接受假照射，照射组接受4 Gy X射线TBI，照射剂量率为0.9 Gy/min。接受TBI的小鼠于SPF级动物房中饲养，每天观察记录体重变化。

1.3.2 小鼠外周血常规检测

小鼠TBI后14 d小鼠眼眶静脉丛取血，抗凝管收集外周血，全自动血液分析仪测定外周血中白细胞数(WBC)、红细胞数(RBC)、血红蛋白含量(HGB)和血小板(PLT)等指标。

1.3.3 小鼠胸腺、脾指数测定

小鼠TBI后14 d称重安乐死，取胸腺、脾并称重，计算脏器指数，脏器指数=脏器(mg)/体重(g)。

1.3.4 骨髓细胞有核细胞计数

小鼠TBI后14 d，无菌分离小鼠胫骨和股骨，剔除肌肉，注射器冲洗骨髓细胞，过滤后采用KOVA一次性计数板，显微镜下人工骨髓计数。最终细胞计数结果以每只小鼠×107个细胞表示。

1.3.5 小鼠骨髓细胞表型分析

小鼠TBI后14 d，收集骨髓细胞至流式管，加入Biotin标记的混合一抗抗体(CD4、CD8、B220、Ter119、Gr1、CD11b)，孵育后洗涤并重悬细胞，加入混合二抗抗体streptavidin(percp标记)、scal-1(PE标记)、ckit(APC标记)，孵育后洗涤并重悬细胞。流式细胞仪检测HPCs(Lin-c-kit+Sca1-or LSK- cells)，HSCs(Lin-c-kit+Sca1+or LSK+cells)[18]在骨髓中所占的比例。

1.3.6 粒细胞巨噬细胞集落形成单位测定[6]

小鼠TBI后14 d安乐死，分离骨髓细胞并分组混合，每组接种40 000个细胞到分装好的2 mL 3534培养基中。按操作说明进行后续接种。接种细胞培养5～7 d后于倒置显微镜下读取粒细胞巨噬细胞集落形成单位(colony forming unit-granulocyte and macrophage，CFU-GM)数，细胞数≥50为阳性集落。结果换算为每105个BMNCs中CFU-GM的个数。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 FOXO3A对受照小鼠外周血计数的影响

TBI小鼠外周血计数结果如图1所示：生理情况下，FOXO3A-/-小鼠与WT小鼠，白细胞数、红细胞数、血红蛋白含量、血小板计数、淋巴细胞和中性粒细胞比例均未见明显差异(P>0.05)。接受4 Gy TBI后，FOXO3A-/-小鼠和WT小鼠白细胞数、红细胞数下降，血红蛋白含量、血小板计数与FOXO3A-/-对照组小鼠和WT对照组小鼠相比均降低(P<0.05); 淋巴细胞和中性粒细胞比例仍未见明显差异(P>0.05)。接受4 Gy TBI的FOXO3A-/-小鼠和WT小鼠间相比，白细胞数目、红细胞数目、血红蛋白含量、血小板含量、淋巴细胞和中性粒细胞比例均未见明显差异(P>0.05)。结果表明：生理情况下，小鼠FOXO3A基因敲除不影响其外周血计数。小鼠接受4 Gy X射线TBI后14 d出现白细胞数、红细胞数下降，血红蛋白含量、血小板计数降低；FOXO3A基因敲除小鼠受照后外周血改变与野生型小鼠没有差异。这提示FOXO3A基因敲除不会影响受照小鼠外周血计数改变。

注：与WT组相比，aP<0.05；与FOXO3A-/-组相比，bP<0.05。图1 FOXO3A基因对受照小鼠外周血计数的影响Note. Compared with the WT group, aP<0.05. Compared with the FOXO3A-/- group, bP<0.05.Figure 1 Effect of FOXO3A on peripheral blood cell counts of the irradiated mice

2.2 FOXO3A对受照小鼠的脏器指数的影响

TBI小鼠体重及脏器指数结果如图2所示：生理情况下，FOXO3A-/-小鼠与WT小鼠，体重、胸腺指数、脾指数均未见明显差异(P>0.05)。接受4 Gy TBI后，WT组小鼠体重与WT对照组小鼠相比降低(P<0.01)，FOXO3A-/-组小鼠体重与FOXO3A-/-对照组小鼠相比未见明显差异(P>0.05)；WT组和FOXO3A-/-组小鼠胸腺指数与WT对照组小鼠和FOXO3A-/-对照组小鼠相比均未见明显差异(P<0.05)，而脾指数均显著下降(P<0.01),但两者下降幅度上未见明显差异(P>0.05)。结果表明：生理情况下，FOXO3A基因敲除不影响小鼠体重及脏器指数。FVB品系小鼠接受4 Gy X射线TBI后14 d，小鼠体重和脾指数降低，FOXO3A基因敲除小鼠受照后体重和脾指数下降与野生型小鼠相比未见明显差异。未发现FOXO3A基因敲除影响受照小鼠体重及脏器指数变化。

注：与WT组相比，aP<0.05；与FOXO3A-/-组相比，bP<0.05；与WT+IR组相比，cP<0.05。图2 FOXO3A基因对受照小鼠体重及脏器指数的影响Note. Compared with the WT group, aP<0.05. Compared with the FOXO3A-/- group, bP<0.05. Compared with the WT+IR group, cP<0.05.Figure 2 Effect of FOXO3A on body weight and organ index of the irradiated mice

2.3 FOXO3A对受照小鼠骨髓细胞计数的影响

小鼠骨髓细胞计数结果如图3所示。结果发现：生理情况下，FOXO3A-/-小鼠骨髓有核细胞数低于WT小鼠(P<0.05)。接受4 Gy TBI后，WT小鼠骨髓有核细胞数与WT对照组小鼠相比降低(P<0.01);FOXO3A-/-小鼠骨髓有核细胞数与FOXO3A-/-对照组小鼠相比未发现明显差异(P>0.05)。进一步分析发现，经受4 Gy TBI的FOXO3A-/-小鼠骨髓有核细胞数下降率为9%，低于WT小鼠51%。结果表明：生理情况下，小鼠FOXO3A基因敲除会降低小鼠体内骨髓有核细胞数；接受4 Gy X射线TBI后14 d，受照小鼠出现骨髓有核细胞数目降低，FOXO3A基因敲除减轻受照小鼠骨髓有核细胞数目降低。这提示FOXO3A基因敲除对小鼠骨髓有核细胞具有一定损伤作用，同时又能抑制辐射诱导的骨髓细胞数目降低。

注：与WT组相比，aP<0.05。图3 FOXO3A基因对受照小鼠骨髓细胞计数的影响Note. Compared with the WT group, aP<0.05.Figure 3 Effect of FOXO3A on bone marrow cell counts of the irradiated mice

2.4 FOXO3A对受照小鼠骨髓细胞分型的影响

TBI小鼠骨髓细胞分型结果如图4所示：生理情况下，FOXO3A-/-小鼠HPCs比例高于WT小鼠(P<0.05)，HSCs比例和数目、HPCs数目均未发现明显差异(P>0.05)。接受4 Gy TBI后，WT小鼠HSCs数目与WT对照组小鼠相比降低(P<0.01)，FOXO3A-/-小鼠HSCs比例和数目、HPCs比例和数目与FOXO3A-/-对照组小鼠相比均降低(P<0.05)。进一步分析发现，接受4 Gy TBI的FOXO3A-/-小鼠HSCs/HPCs比例下降率均显著高于WT小鼠。上述结果表明：生理情况下，FOXO3A基因敲除小鼠体内HPCs比例升高；接受4 Gy X射线TBI后14 d，FOXO3A-/-受照小鼠出现明显HSCs、HPCs比例和数目下降，FOXO3A基因敲除加重受照小鼠HSCs、HPCs比例下降。这提示FOXO3A基因敲除能够影响小鼠体内造血细胞稳态，同时又能加重电离辐射诱导小鼠HSCs、HPCs损伤。

注：流式图中的A、B、C、D分别代表流式细胞仪分析时门的设置。柱形图中，与WT组相比，aP<0.05；与FOXO3A-/-组相比，bP<0.05；与WT+IR组相比，cP<0.05。图4 FOXO3A对受照小鼠的骨髓细胞分型的影响Note. A, B, C, and D in the flow chart represents the gating strategy as analyzed by the flow cytometry, respectively. In the column charts, compared with the WT group, aP<0.05, compared with the FOXO3A-/- group, bP<0.05, and compared with the WT+IR group, cP<0.05.Figure 4 Effect of FOXO3A on bone marrow cell typing of the irradiated mice

2.5 FOXO3A对受照小鼠造血祖细胞增殖功能的影响

TBI小鼠CFU-GM实验结果如图5所示。结果发现：生理情况下，FOXO3A-/-小鼠与WT小鼠CFU-GM形成数未见明显差异(P>0.05)。接受4 Gy TBI后，WT小鼠CFU-GM形成数与WT对照组小鼠相比降低(P<0.001)；FOXO3A-/-小鼠CFU-GM形成数与FOXO3A-/-对照组小鼠相比未见明显差异(P>0.05)；进一步分析发现，接受4 Gy TBI的FOXO3A-/-小鼠CFU-GM形成数高于WT小鼠(P<0.001)。结果表明：生理情况下，小鼠FOXO3A基因敲除不影响HPCs CFU-GM形成能力。小鼠接受4 Gy X射线TBI后14 d，FOXO3A基因敲除抑制受照小鼠CFU-GM形成降低。这提示FOXO3A基因敲除抑制受照小鼠造血祖细胞增殖功能减退。

注：与WT组相比，aP<0.05；与WT+IR组相比，cP<0.05。图5 FOXO3A对受照小鼠造血祖细胞增殖功能的影响Note. Compared with the WT group, aP<0.05. Compared with the WT+IR group, cP<0.05.Figure 5 Effect of FOXO3A on hematopoietic progenitor cell proliferation of the irradiated mice

3 讨论

实验结果显示：生理情况下，FOXO3A基因敲除会降低小鼠体内骨髓有核细胞数，骨髓HPCs比例升高。骨髓有核细胞数降低可能是由于FOXO3A基因敲除导致的造血细胞损伤性改变。HPCs比例升高可能是由于FOXO3A基因敲除影响了HSCs维持静止和自我更新的能力[12]，导致HSCs数目下降，出现HPCs比例相对升高；也可能FOXO3A基因敲除加速HSCs分化，导致HPCs数目增多，这些提示了FOXO3A基因对HSCs功能维持的作用。接受4 Gy X射线照射后14 d，FOXO3A基因敲除抑制辐射诱导的骨髓细胞数目降低和造血祖细胞CFU-GM形成能力减退。FOXO3A基因敲除减轻辐射诱导的骨髓细胞数目降低，可能与FOXO3A基因敲除小鼠未照射时骨髓细胞水平较低有关，也有可能是因为FOXO3A基因敲除影响了HSCs稳态维持能力，促进造血细胞的增殖。FOXO3A基因敲除抑制辐射诱导的造血祖细胞CFU-GM形成能力减退，可能是由于FOXO3A基因敲除阻断电离辐射诱导的HPCs增殖抑制，促进HPCs的增殖。上述结果中受照后FOXO3A基因敲除小鼠HPCs比例明显下降，反映HPCs增殖功能的CFU-GM没有明显改变，提示损伤较重的可能不是粒细胞和巨噬细胞，而是巨核系细胞和红系细胞[19]，与外周血计数变化趋势一致。最为明显的是FOXO3A基因敲除加重受照小鼠HSCs、HPCs比例和数目下降，表明了FOXO3A基因敲除增加了HSCs和HPCs的辐射敏感性。

综上，生理情况下，FOXO3A基因敲除会降低小鼠体内骨髓有核细胞数，导致小鼠体内HPCs比例升高；这说明生理情况下，FOXO3A基因敲除会影响小鼠造血系统稳态的维持，导致造血细胞损伤性改变。受到照射后，FOXO3A基因敲除小鼠HSCs和HPCs损伤最为明显，提示了FOXO3A基因对HSCs和HPCs辐射保护中具有重要作用。

FOXO3A作为机体抗氧化应激和DNA损伤应答信号通路中重要的调节分子，FOXO3A基因敲除可能损伤造血系统稳态维持能力和加重造血系统辐射损伤。我们结果显示全身照射后小鼠HSCs、HPCs变化符合预期。FOXO3A是否能够成为造血细胞辐射损伤保护的靶点还有待于进一步研究。

致谢：感谢中国医学科学院医学实验动物研究所张连峰教授课题组老师在实验中给予的指导帮助。