BTG1过表达对胰腺癌细胞增殖、侵袭和cyclin D1、cyclin B1、MMP-2、MMP-9蛋白表达的影响

王开琼，邢贻雷，乔 欣，李仕总，宫东伟，余智威，吴奕强

(海南省人民医院胆胰外科，海口 570311)

胰腺癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，具有恶性程度高、早期诊断困难、病情进展快和预后效果差等特点，胰腺导管腺癌是其重要的病理类型，约占全部胰腺癌的90%以上[1]。在我国，胰腺癌发病率位居恶性肿瘤的第8位，五年生存率只有7.2%[2]。目前，能够进行手术根除性治疗的患者只有不到20%，大部分患者就诊时已发生局部转移[3]。因此，阐明胰腺癌发生发展的分子机制以及寻找有效的治疗靶点一直是学术界研究的热点。B细胞易位基因1(BTG1)是TOB/BTG家族成员，被报道在喉鳞状细胞癌、胃癌和结肠癌等多种肿瘤组织或细胞中异常低表达，具有调控细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移等多种生物学功能，有望成为肿瘤诊断和治疗的潜在靶点[4-6]。近年来，有报道发现BTG1在胰腺导管腺癌组织中表达下调，且与肿瘤的分期、淋巴结转移和预后不良等密切相关[7]，但BTG1在胰腺癌发生发展中的作用及其机制尚不清楚。因此，本研究通过体外细胞实验构建BTG1过表达的胰腺癌细胞株，探讨BTG1对胰腺癌细胞增殖和侵袭的影响，并探讨其可能的分子机制，以期为胰腺癌的诊治提供新的靶点。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人胰腺癌细胞株PANC-1、AsPC-1、BxPc-3和人正常胰腺导管上皮细胞株H6C7，来源自美国ATCC。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM培养基、青/链霉素和胎牛血清，美国Gibco公司(批号分别为8115051、15140-122、SH41289)；Lipofectamine 2000、Opti-MEM培养基和TRIzol试剂，美国Invitrogen公司(批号分别为11668027、31985-070、15596-026)；二甲基亚砜，上海国药集团化学试剂公司(批号20160915)；碘化丙锭、噻唑蓝(MTT)试剂，美国Sigma公司(批号分别为MKBP1360 V、M2128)；Matrigel基质胶，美国BD Biosciences公司(批号为356234)；细胞IP裂解液、SDS-PAGE上样缓冲液和ECL发光试剂盒，上海碧云天生物公司(批号分别为C1054、P0015、P0018)；鼠抗人BTG1、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、细胞周期蛋白B1(cyclin B1)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)和β肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体，美国Santa Cruz公司(批号分别为、SC-450、SC-70898、SC-10736、SC-21733、SC-47778)；辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠二抗，北京中杉金桥生物公司(批号为107724)；pcDNA3.1-BTG1过表达质粒和pcDNA3.空载体质粒由海南大学生物技术实验中心提供；二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒，上海捷瑞生物公司(批号为1008G18)；逆转录试剂盒，北京智杰方远科技有限公司(批号为K1622)；PCR反应试剂盒，北京百奥莱博科技有限公司(批号为RFT100)。Transwell小室(美国Corning公司)；Eco-170 CO2培养箱(美国Harris公司)；BDS200倒置显微镜(重庆奥特光学仪器公司)；550型全自动酶标仪、GelDoc EZ型凝胶成像分析系统和CFX96实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)；C6流式细胞仪(北京科誉兴业科技公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

采用含有胎牛血清100 g/L和青链霉双抗各100 U/mL的DMEM培养基于CO2体积分数为5%的37℃恒温培养箱中培养PANC-1、AsPC-1、BxPc-3和H6C7细胞株。每2 ～ 3 d换液一次，当细胞铺满瓶底80%左右时，加入0.25%胰蛋白酶消化，并按照1∶3的比例进行传代。

1.3.2 qRT-PCR检测BTG1 mRNA的表达

参照TRIzol试剂说明书提取总RNA，并将其反转录合成单链cDNA。以cDNA为模板，进行PCR扩增。分析产物熔解曲线检测目的基因的特异性，目的基因的相对定量分析采用β-actin内参基因循环阈值进行标准化，数据采用2-△△Ct法进行分析。PCR反应条件：94℃灭活或预变性5 min；94℃变性30 s、60退火30 s、72℃延伸30 s，循环40次，72℃延伸5 min。由美国Invitrogen公司合成的PCR引物序列如下：BTG1-F：5’-CACCATGCATCCCTTCT ACACCCGG-3’，BTG1-R：5’-TTAACCTGATACAG TCATCATATTG-3’；β-actin-F：5’-CCAAGGCCAACC GCGAGAAGATGAC-3’；β-actin-F：5’-AGGTACATG TGTGCCGCCAGAC-3’。实验重复3次。

1.3.3 Western blot检测BTG1、cyclin D1、cyclin B1、MMP-2和MMP-9蛋白的表达

采用IP细胞裂解液提取待测细胞的总蛋白后，并以BCA法测定总蛋白的浓度。总蛋白60 μg/孔在SDS-PAGE凝胶中电泳分离后，转膜。将PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的Tween 20溶液中常温下摇床孵育1 h。4℃下，转入含特异性一抗的Tween 20溶液中摇床孵育24 h。采用Tween 20溶液浸洗10 min × 3次后，37℃下转入含二抗的Tween 20溶液中摇床孵育1 h。再经Tween 20溶液洗膜3次后，加入ECL发光剂暗室内显影曝光。以β-actin为内参，分析目的蛋白的相对表达水平。实验重复3次。

1.3.4 细胞分组及转染

实验分为对照组(未转染)、pcDNA3.1组(转染pcDNA3.空载体质粒)和BTG1组(转染pcDNA3.1-BTG1过表达质粒)，每组设3个复孔。取第5代生长良好的对数生长期BxPc-3细胞以2.5×105个/孔平铺于6孔细胞板上，于细胞培养箱中常规培养至70%融合度时，参照Lipofectamine 2000转染试剂说明书步骤根据实验分组将pcDNA3.空载体质粒和pcDNA3.1-BTG1过表达质粒转染至BxPc-3细胞中。转染24 h后，采用qRT-PCR和Western blot检测转染效果。

1.3.5 MTT法检测BxPc-3细胞增殖能力

采用0.25%胰蛋白酶消化对照组、pcDNA3.1组和BTG1组细胞，以每孔100 μL细胞悬液(浓度为1×104个/mL)接种于96孔板上，每组设置3个复孔。置于培养箱内分别培养48, 72, 96 h后，加入5 mg/mL MTT试剂20 μL /孔。孵育4 h后，弃上清，加入150 μL二甲基亚枫震荡反应15 min。酶联免疫检测仪测定492 nm波长处各组BxPc-3细胞的吸光度(OD)值。实验重复3次。

1.3.6 流式细胞术检测BxPc-3细胞的周期分布

将对数生长期的对照组、pcDNA3.1组和BTG1组(每组3个重复)细胞以0.25%胰蛋白酶消化后，1000 r/min离心5 min弃上清液。经预冷的PBS漂洗2 ～ 3次后，于4℃下加入2 mL预冷的70%乙醇固定24 h。离心弃乙醇后，以PBS漂洗细胞。弃上清后，加入含RNA酶的碘化丙啶溶液避光染色20 min。采用流式细胞仪检测各组BxPc-3细胞的周期变化。实验重复3次。

1.3.7 Transwell小室检测BxPc-3细胞侵袭能力

取Transwel小室放入24孔细胞板中，将Matrigel基质胶以100 μL/孔铺于小室底部的聚碳酸酯微孔膜上。置于4℃下充分聚合成胶。以胰蛋白酶消化待检细胞后，制备浓度为 5×104/mL的细胞悬液。按照每孔200 μL细胞悬液接种至成胶的Transwel小室上层，并于下层中加入600 μL/孔含胎牛血清的细胞培养液。细胞培养箱中常规培养48 h后，以棉签小心擦去未穿膜的细胞。常温下，先以甲醛固定30 min，再以0.5%结晶紫染色15 min。显微镜下观察，结果以随机选取的5个视野细胞数的平均值表示。实验重复3次。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 BTG1在胰腺癌细胞中低表达

qRT-PCR检测发现，与正常胰腺导管上皮细胞H6C7相比，胰腺癌细胞PANC-1、AsPC-1和BxPc-3中BTG1 mRNA的表达水平逐渐降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测与qRT-PCR检测结果相一致，与H6C7细胞相比，BTG1蛋白在PANC-1、AsPC-1和BxPc-3细胞中的表达水平均明显降低(P<0.05)，且BxPc-3细胞差异最为显著。故后续选用胰腺癌BxPc-3细胞进行实验。结果见图1和表1。

图1 胰腺癌细胞中BTG1蛋白的表达Figure 1 BTG1 protein expression in the pancreatic cancer cells

细胞系Cell lineBTG1蛋白BTG1 proteinBTG1 mRNAH6C70.67±0.041.00±0.05PANC-10.35±0.03∗0.82±0.04∗AsPC-10.23±0.03∗0.67±0.03∗BxPc-30.11±0.02∗0.54±0.03∗F值F-value183.15879.780

注：与H6C7细胞系比较，*P<0.05。

Note. Compared with the H6C7 cell line,*P<0.05.

表2 转染效果及上调BTG1表达对细胞增殖的影响

注：与对照组比较，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

2.2 上调BTG1表达抑制胰腺癌BxPc-3细胞增殖

qRT-PCR和Western blot检测发现，转染pcDNA3.1-BTG1过表达质粒的BTG1组细胞中BTG1 mRNA和蛋白的表达水平较对照组明显升高(P<0.05)；而转染pcDNA3.1空载体的pcDNA3.1组与对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。MTT实验检测发现，与对照组相比，BTG1组细胞在48, 72, 96 h时间点的OD值均明显降低，细胞增殖能力减弱(P<0.05)；而pcDNA3.1组与对照组细胞的增殖能力差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图2和表2。

图2 各组中BTG1蛋白的表达Figure 2 BTG1 protein expression in each group

2.3 上调BTG1表达诱导胰腺癌BxPc-3细胞周期阻滞于G0/G1期

流式细胞仪检测发现，pcDNA3.1组细胞在G0/G1期、S期和G2/M期所占的百分比与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；但BTG1组细胞在G0/G1期的百分比明显高于对照组，在S期的百分比明显低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot进一步检测周期相关蛋白cyclin D1和cyclin B1的表达发现，与对照组相比，BTG1组细胞中cyclin D1和cyclin B1蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05)；而pcDNA3.1组与对照组相比，cyclin D1和cyclin B1蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结果见图3和表3。

图3 各组中cyclin D1和cyclin B1蛋白的表达Figure 3 Cyclin D1 and cyclin B1 protein expression in each group

表3 上调BTG1表达对胰腺癌细胞周期的影响

注：与对照组比较，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

表4 上调BTG1表达对胰腺癌细胞侵袭的影响

注：与对照组比较，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

2.4 上调BTG1表达抑制胰腺癌细胞侵袭

与对照组相比，pcDNA3.1组的穿膜细胞数和MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平无明显改变(P>0.05)，而BTG1组的穿膜细胞数以及MMP-2、MMP-9蛋白的表达水平均明显低于对照组(P<0.05)。结果见图4和表4。

图4 各组中MMP-2和MMP-9蛋白的表达Figure 4 MMP-2 and MMP-9 protein expression in each group

3 讨论

BTG1最早是从慢性B淋巴细胞性白血病染色体上得到的，后又从淋巴母细胞中分离出来，定位于12q22染色体上，可通过调控细胞周期进程调节细胞的增殖过程，在肿瘤的发生发展过程中扮演着重要角色[8]。BTG1在食管癌组织中表达降低，与肿瘤的淋巴结转移、临床分期、组织学分级和总体生存时间显著相关，上调其表达后，可通过抑制cyclin D1、Bcl-2和MMP-9蛋白的表达减弱Eca-109细胞的增殖、侵袭、迁移能力，增强细胞凋亡能力，升高G0/G1期细胞比例[9]。BTG1在胃癌组织中的表达明显低于非肿瘤性粘膜和淋巴结转移癌，与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、TNM分期和预后效果差等呈正相关，BTG1过表达能够明显抑制BGC-823和MKN28细胞的增殖、迁移和侵袭，并诱导细胞周期G2/M期阻滞、细胞分化、衰老和凋亡[10]。在结直肠癌中，BTG1过表达可诱导HCT-15细胞阻滞于G2期，也可诱导HCT-116细胞阻滞于G1期，同时也可增强肿瘤细胞对紫杉醇和顺铂等化疗药物的敏感性[6]。可见，BTG1在肿瘤发生发展过程中发挥着类似抑癌基因的作用，并可能是肿瘤潜在的生物标志物和治疗靶点。有报道发现，BTG1在胰腺癌组织中异常低表达，与临床分期、淋巴结转移和预后不良等有关[7,11]，但目前BTG1在胰腺癌发生发展中的作用并不明确。本研究通过体外细胞实验，初步验证了BTG1在人胰腺癌细胞株PANC-1、AsPC-1、BxPc-3中低表达。通过转染pcDNA3.1-BTG1过表达质粒成功构建BTG1过表达的BxPc-3细胞株后，检测发现BxPc-3细胞的增殖和侵袭能力明显减弱；同时发现，BxPc-3细胞在G0/G1期的百分比明显升高，S期的百分比明显降低，细胞被阻滞于G0/G1期。该结果与BTG1在既往研究中发挥的抑癌基因的结果相一致。

细胞周期失控导致的肿瘤细胞恶性增殖是肿瘤发生发展的重要原因，该过程受到细胞周期依赖性蛋白激酶和细胞周期蛋白等多种因子的共同调控；cyclin D1和cyclin B1是调节细胞周期活性的两种重要的周期蛋白，前者是调控G1/S期转变的G1期细胞周期蛋白，后者是促进G2/M期转换的分裂期周期蛋白，两者均在胰腺癌组织或细胞中异常表达，参与细胞的周期调控，进而推动肿瘤细胞的恶性增殖[12-13]。进一步检测cyclin D1和cyclin B1蛋白的表达发现，BTG1过表达可下调BxPc-3细胞中cyclin D1和cyclin B1蛋白的表达。这一结果与Zhu等[14]研究得到的BTG1过度表达可通过抑制cyclin D1和cyclin B1表达诱导细胞阻滞于G0/G1期，抑制乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖的分子机制相吻合。这也提示，BTG1过表达可能通过抑制cyclin D1和cyclin B1表达诱导胰腺癌细胞周期阻滞于G0/G1期，进而抑制癌细胞增殖。胰腺癌的发生发展不仅与肿瘤细胞的恶性增殖有关，细胞的侵袭也是影响其进展的重要因素。基质金属蛋白酶家族是一类与细胞侵袭和转移关系密切的锌依赖性内肽酶家族，MMP-2和MMP-9是该家族中重要的明胶酶，在胰腺癌细胞侵袭和转移过程中发挥着重要作用[15-16]。为了进一步探讨BTG1调控胰腺癌细胞侵袭的分子机制，本研究进一步检测发现，在BTG1过表达的BxPc-3细胞中MMP-2和MMP-9蛋白的表达明显受到抑制。提示，BTG1过表达可能通过下调MMP-2和MMP-9表达抑制胰腺癌细胞的侵袭。

综上所述，BTG1在胰腺癌细胞中低表达，在胰腺癌的发生发展过程中可能起着负调控作用。上调BTG1表达可通过抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭，其作用机制可能与下调cyclin D1、cyclin B1、MMP-2和MMP-9表达有关。BTG1具有多种生物学功能，本研究仅涉及到了胰腺癌细胞增殖、细胞周期和细胞侵袭部分生物学作用，后期将会从胰腺癌细胞凋亡及放化疗方面入手探讨BTG1在胰腺癌中的作用，为以BTG1为靶点的胰腺癌基因治疗提供实验依据。