乙酰紫草素诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡的实验研究

2019-09-27何茂旭韩丽丽刘盈盈孙森森

中国实验诊断学 2019年9期

何茂旭，韩丽丽，王佩，付莉*，裴越，刘盈盈，孙森森

(1.吉林大学第二医院妇产科，吉林长春130041；2.青岛市中心医院妇产科，山东青岛266042)

卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一,其病死率居妇科恶性肿瘤首位，患者5年生存率低于30%[1]。目前卵巢癌的治疗主要以手术为主、放化疗为辅综合治疗，但对于手术不能完全切除晚期患者，化疗成为卵巢癌综合治疗的重要组成部分。然而化疗药耐药性已成为卵巢癌治疗的重要问题之一[2]。乙酰紫草素是一种天然的红色色素，存在于我国传统常见中药—紫草的根中，具有抗炎和抗肿瘤活性[3]。乙酰紫草素对多种肿瘤细胞如结肠癌、胰腺癌及乳腺癌等具有一定的抑制作用[4-6]。本实验主要探讨乙酰紫草素是否能诱导卵巢癌SKOV3细胞凋亡。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：Multiskan FC型酶标仪(美国Thermo公司)，BD FACSVia型流式细胞仪(美国BD Biosciences公司)，Ti-E型荧光显微镜(日本Nikon公司)。

试剂：乙酰紫草素(纯度98%，上海纯优生物)，青霉素，链霉素，胰蛋白酶，MTT，1640培养液(Hyclone,US) ，胎牛血清(天津灏洋生物)，Annexin V/FITC及PI双染试剂盒(Sigma，US)。

细胞：卵巢癌SKOV3细胞株(中国科学院上海细胞生物研究所)。

1.2 方法

1.2.1MTT法检测SKOV3细胞的抑制率将对数生长的卵巢癌SKOV3细胞悬液,以5×105个/mL密度接种在96孔板,每孔100 μl,每组设5个复孔。标准条件下培养过夜,于48小时加入含新的乙酰紫草素的培养液,乙酰紫草素每孔终浓度分别为1，5，10，20，30，40，50，60，70,80,90 μmol/L，对照组不加乙酰紫草素(只含等量培养基),各组细胞均培养48小时后加入10 μl MTT溶液(5 mg/mL)处理,加入100 μl DMSO,避光振荡10 min,并通过酶标仪在490 nm波长下检测每个孔的吸光度值(A),每组浓度重复检测3遍,计算平均值,然后计算乙酰紫草素对SKOV3细胞的抑制率。抑制率(%)=(1-A实验组/A对照组)×100%。

1.2.2流式细胞仪检测细胞凋亡率乙酰紫草素处理卵巢癌SKOV3细胞，PBS洗涤两次并重悬于结合缓冲液中,然后加入5 μl Annexin V-FITC。此外，加入5μL PI,将细胞在室温黑暗中孵育10 min,并通过流式细胞术测量凋亡率。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 乙酰紫草素对卵巢癌细胞系SKOV3的抑制作用

本研究中不同浓度的乙酰紫草素对SKOV3细胞均有不同程度的抑制作用，当乙酰紫草素浓度低于40 μmol/L时，随着乙酰紫草素浓度增加，对细胞的抑制率显著增加，4种浓度(1、5、10、20 μmol/L)之间的抑制率有统计学差异，P<0.05。当乙酰紫草素浓度大于40 μmol/L后，抑制率不再明显增加，进入平台期。根据计算IC50为10.85 μmol/L(见图1)。

2.2 应用乙酰紫草素后SKOV3细胞周期和凋亡率的变化

本实验选用乙酰紫草素IC50浓度(10.85 μmol/L)作用于卵巢癌SKOV3细胞，48小时后测量SKOV3细胞的凋亡率和细胞周期，结果见表2。

图1 不同浓度乙酰紫草素对SKOV3细胞作用的量效曲线

3 讨论

乙酰紫草素做为中国传统中药—紫草的主要成分，其药理作用十分广泛，现代药学研究证明抗肿瘤作用是其主要作用之一[7]。已有研究证实乙酰紫草素能抑制多种肿瘤细胞增殖[8]。通过本实验，我们发现乙酰紫草素也能抑制卵巢癌SKOV3细胞的生长，但具体机制尚不清楚。有研究发现，在肺癌细胞中，乙酰紫草素可以诱导孤儿受体Nur77的表达和线粒体定位，从而诱导其发生凋亡。Liu[9]等人还发现乙酰紫草素可以通过TR3/Bcl-2途径诱导Nur77线粒体转运并诱导细胞凋亡,从而发挥抗肿瘤的作用。因此，我们猜想，乙酰紫草素抑制卵巢癌SKOV3细胞生长的机制可能也与其诱导Nur77线粒体定位有关。并且已有相关文献报道[10]在肿瘤细胞中,Nur77可能改变Bcl-2的表型作用于线粒体,最终导致细胞凋亡。由此也进一步为我们的猜想提供了一定的理论依据。