基于SELDI-TOF-MS技术筛选乳腺癌血清蛋白标志物

孙亚冬，王家祥，崔树德*

(郑州大学附属肿瘤医院 1.乳腺科；2.外科，河南 郑州450008)

乳腺癌是全球范围内女性最常见的恶性肿瘤，死亡率仅次于肺癌为第二位[1]。乳腺癌的预后与疾病分期及生物分型密切相关，目前早期诊断仍然是治愈的关键[2]，如何寻找敏感性高、特异性高并且可以用于早期诊断和筛查的生物指标，发现尚处于亚临床病变阶段的肿瘤对临床意义重大[3,4]。本研究通过收集乳腺癌患者和正常健康女性的血清标本，应用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(SELDI-TOF-MS)技术，分别研究乳腺癌术前组与健康对照组、乳腺癌术前组与术后组、三阴性乳腺癌组与非三阴性乳腺癌组之间血清蛋白质谱的变化特征，以期寻找到相关的血清蛋白质标记物，进而对于乳腺癌的早期诊断、疗效评价及不同亚型的预后分析提供一定帮助。然后联合MALDI-TOF-MS、Tricine-SDS-PAGE和Western blot 等多种蛋白质组学技术对筛选出的目标蛋白质进行鉴定和验证，最终确定乳腺癌血清特异蛋白标记物，从而为乳腺癌的早期诊断及三阴性乳腺癌的潜在靶点寻找依据和参考。

1 材料与方法

1.1 血清样本收集与处理

收集郑州大学附属肿瘤医院女性乳腺癌患者资料总计60例，时间自2011年06月至2014年6月，其年龄范围为23-70岁，平均年龄为46.7+0.4岁，病理明确诊断为乳腺癌，所有患者入组前未接受治疗，诊断明确后均接受手术治疗，术后规范接受化疗、放疗或内分泌治疗。其中确诊为三阴性乳腺癌的患者占22例。同时收集健康女性的血清样本20例，设为健康对照组。所有参与实验的患者及健康对照者，都已了解相关内容，并征得知情同意。

入组乳腺癌患者术前、对应术后2周的标本，两组均为60例。所有患者均在清晨06:30-7:30抽血留取标本，要求空腹状态，标本于室温下静置0.5-1 h，然后放入离心机进行离心，转速3 000 r/min，离心时间20-30 min，离心后标本抽取上清液至EP管，做好标记后放入-80℃冰箱保存。

1.2 仪器和设备

SELDI-TOF-MS、96孔蛋白芯片(Bioprocessor)、SELDI芯片、WCX芯片、CHAPS(3-环乙胺-1-丙磺酸)、乙腈(Acetonitrile)、DTT(1,4-二硫代苏糖醇)、TEMED(四甲基乙二胺)均购于美国Ciphergen公司，MALDI-TOF-MS购于英国Kratos Analytical公司，真空冷却离心浓缩系统(SPD SpeedVac)购于美国Thermo Electron Inc公司，胰蛋白酶(Trypsase)于美国Promega Inc公司。

1.3 方法

1.3.1血清样本的处理 解冻血清标本，室温下溶解，然后离心(4℃，10 000 r/min)，将离心后的样本加入96孔细胞培养板，每孔加入5 μl样本，然后加入10 μl U9缓冲液，并加入1% Bar、2%CHAPS各10 μl，放入4℃层析柜内，振荡大约30 min，500 r/min。

1.3.2SELDI-TOF-MS技术筛选血清样本 将芯片装入加样器Bioprocessor中，每孔中加入NaAC(100 mmol/L，pH4)200 μl，放入层析柜中，以600 r/min振荡2 min，然后重复上述操作过程1次。将经过U9处理后的96孔板Bioprocessor置于冰盒上，加入NaAC185 μl，这一步骤使用排枪操作，然后再次放入层析柜中，4℃条件下，600 r/min震荡2 min。在蛋白质芯片上加入已处理的样本100 μl，放置于层析柜中，4℃条件下，600 r/min结合60 min，然后甩去残液，快速拍干。加入NaAC200 μl，600 r/min振荡5 min后，方法同前，以上操作重复3次。使用200μl去离子水将各孔冲洗两次，仔细甩干，将芯片风干，每孔加入50%饱和的SPA 1 μl，分两次进行，等待芯片干燥后上机。设置参数如下：分子量范围为2000Da-20000Da，最高分子量为30000Da，使用Ciphergen Biosystems 软件(3.1版)校正原始试验数据，使数据的总离子强度和分子量实现均一化；使用Biomarker Wizard软件包和ZUCI-ProteinChip Data软件包来过滤噪音和去除基线。并检测仪器的运行情况及灵敏度，然后把装有检测样本的蛋白质芯片板放入质谱仪中，通过MELDI-TOF-MS系统，进行数据收集，并应用相应软件对数据进行处理，分别获取到各个样本的m/z峰(质/荷比)，数据中差异性<0.3% 的被认为是同一种蛋白质。

1.3.3乳腺癌血清中特异性蛋白质的鉴定 根据SELDI-TOF-MS筛选出的乳腺癌特异性蛋白质标记物，即(m/z)位于6448的蛋白质或肽段，选取6448的蛋白质或肽段峰值高表达的血清样本进行纯化及鉴定。对样本进行筛选后制备凝胶，收集乳腺癌组样品血清2 ml，然后加入超纯水，稀释至5 ml，再进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)分离，步骤如下：把两块玻璃板(厚度为0.75 mm)清洗干净，夹紧固定于胶架上，先后加入分离胶和浓缩胶，需要等待胶体完全凝固后进行上样，将5 μl指示剂加入到前期处理后的样本中，沸水浸泡，约15-20 min，取出，然后5000 r/min离心，时间5 min，然后取上清液10 μl，小心加至胶体梳齿槽中，将Marker加入第一槽作为参照。然后将初始电压设为30 v，待样本电泳到浓缩胶与分离胶的分界处时，调至电压为100 v，继续电泳4-6 h小时以后，等待指示剂接近胶体底部的时候，关掉电源，取出玻板，将浓缩胶和分离胶进行分离，浓缩胶进行移除，仔细分离分离胶并放入清洁培养皿中进行考马斯亮兰染色，染色时间为6-8小时。将染色成功后的分离胶进行切取，用标记好的EP管分装。参照胶内酶解试剂盒的说明书，经酶解得到目标蛋白。向样本中加入提取液，然后对上清液进行提取，将基质添加至上清液后，在蛋白质芯片板上进行点样，然后放入MALDI-TOF/TOF中，经过激光轰击，肽段序列进行收集，然后利用Mascot软件，继而与Swiss Prot数据库连接、进行匹配和比对，最终得到目标蛋白质。

1.4 统计学方法

对质谱原始数据进行处理，通常通过噪音过滤和聚类分析，对筛选出的m/z峰进行统计学检验，采用Wilcoxon秩和检验，并对不同实验组质谱数据进行t检验，检验水准α=0.01。

2 结果

2.1 乳腺癌组与健康对照组间的比较

将乳腺癌组与健康对照组之间的蛋白质谱进行标准化处理后，再进行聚类分析，得到两组各自的差异蛋白峰值，然后对两组蛋白峰值进行Wilcoxon秩和检验，共收集到14个具有差异性的蛋白峰值(P<0.01)，其中有11个在乳腺癌组呈高表达，3个在乳腺癌组呈低表达。通过SVM回归，筛选出其中Youden指数最高的模型，差异蛋白峰为定位于6448的蛋白质标记物，与健康人群相比，在乳腺癌患者中，m/z峰定位于6448的蛋白标记物低表达。其在乳腺癌组低表达强度为38.0187±34.2194，而在正常组高表达，表达强度为337.5261±507.6438，差异有显著的统计学意义(图1、2)。

图1 m/z 6448 在各组中的对比质谱图(0为正常组，1为乳腺癌组)

图2 m/z 6448 在不同组中的模拟电泳图，红色条带处(0为正常组，1为术前组)

2.2 乳腺癌术前组与术后组间的比较结果

对乳腺癌术前组与术后组进行质谱分析，得到具有差异性的蛋白质峰值(P<0.01)，共筛选出6个，其中有4个在乳腺癌术前组呈高表达，2个低表达。通过支持向量机(SVM)，将Youden指数最高的模型筛选出来，最终得到m/z峰位于6448的蛋白标记物，其在术前组表达强度为38.0187±34.2194，术后组表达强度为294.1245±102.8634，差异具有统计学意义(图3、4)。

2.3 三阴性乳腺癌组与非三阴性乳腺癌组的比较结果

采用SELDI-TOF-MS技术平台对三阴性乳腺组与非三阴性乳腺癌组进行质谱分析，得到具有差异性的蛋白质峰值(P<0.01)，共筛选出9个，其中有4个在三阴性乳腺癌组低表达。通过SVM筛选出Youden指数最高的模型，也可以得到m/z峰位于6448的蛋白标记物，其在三阴性乳腺癌中表达强度为5.1351+3.6437，非三阴性乳腺癌组表达强度为43.6162±18.8542，两组比较差异具有统计学意义(P=0.000163，<0.01)(图5、6)。

图3 m/z 6448在各组中的对比质谱图(0为乳腺癌术前组，1为术后组)

图4(m/z) 6448在不同组中的模拟电泳图，红色条带处(0为术前组，1为术后组)

图6 m/z 6448在不同组中的模拟电泳图，红色条带处(0为非三阴性乳腺癌组，1为三阴性乳腺癌组)

2.4 特异性蛋白质的鉴定

以Marker所提供的分子量作为参照标尺，切取相对应的分子量轴上目标蛋白条带，然后进行酶解离心，再取上清液，使用MALDI-TOF/TOF技术获取到肽段混合物并对其进行检测鉴定。结果显示，含有m/z6448的纯化液经过检测得到的蛋白片段(表1)，将检测出的m/z为6448Da的蛋白质肽段样品进行酶解，然后通过MALDI-TOF/TOF系统进行肽段检测。m/z为6448 Da的蛋白质或肽段其序列为：LK EFGNTLEDKA RELISRIKQS ELSAKMREWF SETFQKVKEK，将肽段导入SEQUEST检索程序并在Bioworks数据库检索，此肽段为载脂蛋白C-I(apolipoprotein C-I,APO C-I)。图7为鉴定m/z为6448Da的蛋白质或肽段酶解的部分肽段的质谱图。

表1 质荷比为6448Da的蛋白质或肽段及其酶解后的肽段序列

图7 鉴定质荷比为6448Da的蛋白质或肽段酶解的部分肽段质谱图

3 讨论

本研究通过SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术筛选出质荷比(m/z)为6448的蛋白质峰，然后联合MALDI-TOF-MS、Tricine-SDS-PAGE等技术对筛选出的目标蛋白质进行鉴定和验证，质荷比6448蛋白质为载脂蛋白C-I肽段(ApoC-I)。同时发现载脂蛋白C-I肽段在乳腺癌患者血清中明显降低，显著低于健康对照人群；而患者术后血清中载脂蛋白C-I肽段有上升趋势；在三阴性乳腺癌组表达低于非三阴性乳腺癌组。这一结果不仅发现了可以用于乳腺癌早期诊断和检测预后的新型生物指标，而且提示我们载脂蛋白ApoC-I肽段对乳腺癌有一定的保护性作用，载脂蛋白ApoC-I肽段与肿瘤细胞增殖分化可能呈负相关。因为我们看到作为乳腺癌亚组中恶性程度最高、侵袭性最强、转移能力最强的三阴性乳腺癌组，这一蛋白质肽段的表达更低，它的生物学作用和机制需要进一步探索。

三阴性乳腺癌约占乳腺癌的15%-20%，是乳腺癌所有分子分型里预后最差、复发转移风险最高的一种亚型，因为缺乏有效的治疗手段，仅仅对化疗敏感，内分泌治疗和分子靶向治疗均不敏感，因此，三阴性乳腺癌的治疗一直是困扰临床多年的难题，目前越来越多的研究试图寻找三阴性乳腺潜在的治疗靶点[5,6]。我们的研究发现m/z峰定位于6448的蛋白标记物在侵袭性较高的三阴性乳腺癌中表达低于非三阴性乳腺癌，这也提示我们这一蛋白标记物的降低与乳腺癌肿瘤恶性程度的升高可能相关，初步建立了SELDI-TOF-MS蛋白质芯片技术结合SVM的乳腺癌血清尤其是三阴性乳腺癌血清蛋白筛选模型[7]。

目前，关于载脂蛋白与肿瘤关系的研究还非常少，以往对于载脂蛋白的研究主要集中在其对脂蛋白代谢的调节上[8-10]，近年来有一些研究报道了载脂蛋白C-I在细胞功能调节方面的作用，除了在脂质代谢方面的作用，一些激酶可以被载脂蛋白C-I激活或抑制，进而实现调节生理或病理过程的作用，与癌症的发生发展有关。Yasui等[11]通过基因表达分析(SAGE)发现与正常胃上皮细胞相比，载脂蛋白C-I在胃癌细胞中表达上调等。Christine等[12]通过对胰腺癌组织进行原位杂交发现，载脂蛋白C-I在侵袭性胰腺癌组织中高表达。Yamamoto-Ishikawa等[13]对激素耐药的前列腺癌进行研究，发现载脂蛋白C-I定位于这类前列腺癌的细胞质中，在疾病进展过程中血清载脂蛋白C-I蛋白表达水平升高。这些结果都表明载脂蛋白C-I可能参与了多种类型的癌症的发生及发展过程，目前参与发病的确切机制还不清楚，值得进一步探讨。Goncalvesa等[14]一项对乳腺癌术后病人血清蛋白质组学研究，筛选并鉴定出差异蛋白质为载脂蛋白AI和载脂蛋白CI，并且发现两者在术后复发转移组均呈低表达。这一结论和我们的研究结果非常类似，均提示载脂蛋白CI的低表达可能与乳腺癌较差的预后有关。同时再次印证了血清蛋白质组学研究对于预测乳腺癌复发转移有一定积极的临床意义。

综上所述，ApoC-I肽段在乳腺癌患者中明显低于健康人群，术后随着瘤荷的降低ApoC-I肽段随之升高，而且在侵袭性较强、恶性程度较高的乳腺癌亚型中ApoC-I肽段的表达更低，是因为肿瘤的发生导致ApoC-I的表达量消耗性下降，还是因为ApoC-I的表达量下降而导致肿瘤的发生，二者之间的作用机制及原理，均有待更深入研究。