乳腺癌中免疫组化双重染色判定Ki-67增殖指数的价值

李 悦，于秀文

(齐齐哈尔医学院 病理学院，黑龙江 齐齐哈尔161006)

Ki-67是细胞增殖相关蛋白，其抗原的免疫组化检测用于评估肿瘤增殖情况已经多年。目前Ki67评估主要用于估计预后和指导辅助治疗的选择[1]，以及预测ER+/HER2-乳腺癌对新辅助治疗的反应和(或)最终的临床结果[2，3]。因此，Ki-67增殖指数在乳腺癌治疗方案的选择和预后评估上起着越来越重要作用[4]，应对所有乳腺浸润性癌在化疗前后进行Ki-67检测，并对癌细胞中阳性染色细胞所占的百分比进行报告。但是Ki-67不仅在癌细胞中表达，还在一些增殖活性高的其他细胞，比如癌组织周围浸润的淋巴细胞中也有不同程度的表达。因此准确评估Ki-67的增殖指数相对较困难，尤其对于经验比较少的医生来说就更为困难。本文应用Ki-67与CK(广)免疫组化双重染色法探讨乳腺癌中Ki-67增殖指数，为乳腺癌预后评估和指导辅助治疗的选择提供依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源与处理选取黑龙江省齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心2016年1月-2018年8月经手术切除的女性乳腺浸润性癌(浸润性导管癌)组织石蜡包埋标本103例，年龄34-69岁，平均年龄46.3岁，所有病例术前均未进行激素、化疗等其它治疗，每例组织内含有不同数量的淋巴细胞。组织经中性福尔马林固定，常规脱水、透明、石蜡包埋，4 μm厚连续切片，裱在涂有10%多聚赖氨酸的载玻片上。所有病例与患者签署知情同意书并经齐齐哈尔医学院伦理委员会同意。

1.2 免疫组化试剂即用型鼠抗人CK(AE1/AE3)单克隆抗体(广州安必平医药科技有限公司)，即用型兔抗人Ki-67单克隆抗体(基因科技上海股份有限公司)，DouMaxVisionTM免疫组化双染试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司)，二步法免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司)。

1.3 实验方法本实验采用免疫组化双重染色法，同时用免疫组化SP法进行对照，具体步骤按试剂盒说明书进行。组织切片常规脱蜡至水，蒸馏水洗1次，EDTA(PH8.0)高压修复2 min，PBS冲洗3 min×3次，3% H2O2室温孵育10 min；PBS冲洗3 min×3次，动物非免疫血清室温孵育15 min，甩干玻片；滴加一抗(Ki-67)50 μl 4℃过夜；PBS冲洗3 min×3次，滴加二抗(辣根过氧化物酶羊抗兔IgG聚合物)工作液50 μl，室温孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次；辣根过氧化物酶显色试剂AEC显色，显微镜下观察显色效果；蒸馏水冲洗5 min；滴加双染增强剂10 min，PBS冲洗3 min×3次，滴加一抗(CK AE1/AE3)50 μl 4℃ 过夜；PBS冲洗3 min×3次，滴加二抗(碱性磷酸酶标羊抗小鼠IgG聚合物)工作液50 μl，室温孵育15 min，PBS冲洗3 min×3次；碱性磷酸酶显色试剂BCIP/NBT显色，显微镜下观察显色效果；自来水冲洗 5 min。苏木素复染10 s，自来水冲洗返蓝，AEC水性封片剂封片，中性树胶封边。Ki-67、CK(广)免疫组化染色做阳性对照，PBS代替一抗做阴性对照。

1.4 结果判定

所有切片采用盲法由两位病理科医生独立阅片，CK(广)蛋白定位于细胞质，Ki-67定位于细胞核。随机观察10个高倍视野，每个视野记数100个细胞，根据Ki-67阳性细胞的比率进行评定。(1)按阳性细胞的比率评分：0分为阳性细胞数占总细胞数≤5%；1分为5%-20%；2分为21%-40%，3分为41%-60%，4分为60%以上。(2)按染色强度评分：0分为细胞无棕色颗粒与背景一致；1分为细胞出现弱棕色或棕黄色颗粒；2分为出现中等强度棕色或棕黄色颗粒；3分为出现强棕色或棕黄色颗粒。(3)总积分=阳性细胞的比率评分+染色强度评分：0分为阴性(-)；1-2分为弱阳性(1+)；3-5为阳性(2+)；6-7为强阳性(3+)。

1.5 统计学分析

应用SPSS17.0 for Windows统计软件进行统计学分析，Ki-67在两组不同方法的表达采用χ2检验，P<0.05具有统计学意义。

2 结果

Ki-67阳性染色位于细胞核，表达于乳腺癌细胞及周围浸润的淋巴细胞中。CK(广)定位于细胞质，表达在上皮细胞即乳腺正常腺上皮细胞及乳腺癌细胞。免疫组化双重染色Ki-67呈红棕色，CK(广)呈蓝色，当两者同时出现染色时即为双重染色阳性，而对照组Ki-67及CK(广)均呈棕黄色(图1-3)。乳腺癌细胞免疫组化双重染色与常规免疫组化染色相比，Ki-67比值“1+”增高，“3+”减少，经χ2检验具有统计学意义(表1)。

图1乳腺癌组织CK(广)表达于癌细胞 图2乳腺癌组织Ki-67表达于癌细胞图3CK(广)及Ki-67共表达 免疫组浆，SP法 放大200倍及淋巴细胞核，SP法放大200倍化双重染色 放大200倍

表1 103例乳腺癌Ki-67常规免疫组化与免疫组化双重染色比较

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，根据癌细胞ER、PR、Her-2、CK5/6蛋白的表达情况可分为不同的分子亚型[5]，每种亚型具有不同的预后及治疗方法。Ki-67在预后的判断及对新辅助化疗的反应上起到了一定的作用[6]，精准检测Ki-67的比率显得尤为重要。免疫组化双重染色技术是在一张切片上同时显示两种抗原，此种方法定位清晰，对比明显，易于观察，避免反复切片，节约标本资源，尤其对于小的、珍贵的活检组织，更是一种非常好的实验方法[7]。

Ki-67与CK(广)在肿瘤的诊断及鉴别诊断中是常用指标。Ki-67是一种增殖细胞相关核抗原，其阳性说明细胞增殖活跃，并提示肿瘤的恶性程度[8]。通常情况下，Ki-67百分比越高，恶性程度越高。但Ki-67在增殖活跃的细胞中都有表达，尤其是癌组织周围浸润的淋巴细胞，而Ki-67免疫组化单染色不能确定Ki-67表达的细胞是否是肿瘤细胞，给Ki-67的判断带来了不准确性。CK(广)主要分布于上皮细胞，是角质细胞的主要骨架蛋白，其主要功能是维持上皮组织的完整性及连续性[9]。CK阳性表达见于上皮细胞、间皮细胞、癌、间皮瘤等。Ki-67与CK在同一组织分别进行免疫组化单染色，虽然也能观察出肿瘤细胞的增殖情况，但是定位比较费力，不能准确地计算出Ki-67的百分比。本文在同一张切片中进行Ki-67与CK双重染色，用CK标记出癌细胞，在此基础上观察Ki-67的表达，起到了直观、定位准确，对比清晰的作用。并且用两种染色比较乳腺癌细胞Ki-67表达结果表明，免疫组化双重染色比免疫组化单染色Ki-67比值“1+”增高，“3+”减少，具有统计学意义，提示免疫组化双重染色更能准确判断肿瘤细胞中Ki-67的表达情况，尤其对于乳腺癌应用新辅助化疗前的病人，穿刺标本应用此种方法可节约标本，对比清晰，对于判断Ki-67的表达情况具有更大的帮助。