戊酸雌二醇对去卵巢大鼠下丘脑视前区肾上腺素能受体表达的影响

马晓艳，王文娟，李银凤，刘改文，秦丽华

0 引 言

潮热是围绝经期妇女最典型的症状，严重时明显影响女性生活质量。潮热发生的确切机制仍然不清，但其发生作为一种异常的散热过程与下丘脑体温调节中枢的神经元突然发放冲动有关。目前国际公认潮热的发生是中枢体温调节热中性带（thermoneutral zone）变窄学说［1-3］。我们前期工作观察到，去卵巢大鼠下丘脑视前区温度敏感核团的温度敏感范围减少［4］，与此学说结论一致。围绝经期妇女下丘脑视前区（preoptic anterior hypothalamus，POAH）体温调节功能的失调涉及多种神经递质和雌激素对体温调节神经元的共同影响。1963年，Feldberg和Myers［5］首次发现去甲肾上腺素和5-HT在下丘脑视前区的平衡状态决定体温调定点水平的高低。我们的前期工作提示，中枢5-HT系统参与围绝经期潮热的发生［6］。肾上腺素α2受体激动剂可乐定可以提升有潮热症状妇女的热阈值，以此来增宽热中性带来缓解潮热症状，支持了脑内高水平的去甲肾上腺素可以缩窄热中性带的假说［7］。雌激素是缓解围绝经期潮热症状最有效的药物，但潮热发生似乎与雌激素的绝对水平无关，而与雌激素撤退后的波动水平有关系［8］。雌激素对脑内肾上腺素能受体的调节作用可能是潮热发生的主要机制之一［9］。研究表明，去甲肾上腺素（Norepinephrine，NE）可激动所有的肾上腺素能受体［10］，作用的受体不同，其发挥的功能就不同［11］。下丘脑肾上腺素能受体对体温的调节主要是通过α受体的作用，β受体并不参与这一调节［12］。肾上腺素α1受体可能与散热相关［13］，肾上腺素α2受体主要参与潮热的启动过程，但目前为止，去甲肾上腺素系统在围绝经期潮热症状中的变化仍然缺少基础方面的研究。本研究拟观察与体温调节关系密切的肾上腺素α1和肾上腺素α2受体在去卵巢大鼠以及雌激素类药物干预后的丘脑视前区的表达变化，以期探讨围绝经期潮热发生的中枢神经递质机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物清洁级雌性SD大鼠30只，体重（230±10）g，由北京大学医学部实验动物科学部提供，实验动物使用许可证号：SYXK（京）2016-0041。实验前置大鼠于室内适应环境1周，并用去大豆的颗粒型饲料喂养至实验结束，去除植物雌激素对实验结果的影响。室温维持在25℃，相对湿度50%～55%，光暗周期为12 h：12 h，实验期间大鼠允许自由饮水和摄食。

1.1.2 主要试剂抗α1-肾上腺素受体、抗α2-肾上腺素受体兔多克隆抗体购自英国Abcom公司；戊酸雌二醇由拜耳医药保健有限公司广州分公司生产，批号169A 11，商品名补佳乐，1mg/粒。

1.2 方法

1.2.1 实验分组待30只实验动物适应周围环境1周后，随机数字表法分为去卵巢组（OVX组）、假手术组、OVX后戊酸雌二醇处理（OVX+E2）组，各10只。无菌条件下进行手术。大鼠麻醉成功后，腹部正中2～3 cm长切口，假手术大鼠只打开盆腔找到卵巢，并未将其切除；OVX组和（OVX+E2）组大鼠行双侧卵巢切除术，（OVX+E2）组行戊酸雌二醇灌胃。所有大鼠术后第3天开始行阴道细胞涂片观察手术效果，连续5 d出现外底层细胞证明大鼠体内雌激素水平降低，卵巢摘除手术成功。

1.2.2 给药剂量和途径所有大鼠术后恢复2周，开始进行实验研究处理。实验用药按照前期工作的方法配制：戊酸雌二醇片剂超声处理后溶于无菌等渗盐水中形成均匀的浑浊液。戊酸雌二醇的配制浓度为0.2 mg/mL；于每日上午8：30-9：30按照以下剂量灌胃给药。OVX组：等渗盐水灌胃，10 mL/kg；假手术组：等渗盐水灌胃，10 mL/kg；（OVX+E2）组：戊酸雌二醇灌胃，0.8 mg/kg；大鼠隔日称重，根据体重变化调整用药量。

1.2.3 切片制备药物治疗满4周后，用1%戊巴比妥钠（40 mL/kg）麻醉大鼠，开胸暴露心脏，剪开右心耳，左心室插管至升主动脉，200 mL等渗盐水冲洗血液，然后用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L的磷酸缓冲液（pH7.4，4℃）300 mL灌注固定，先快后慢。灌毕，立即取脑并置于含4%多聚甲醛的0.1 mol/L的磷酸缓冲液（pH7.4，4℃）后固定4～6 h，倾去固定液，用自来水洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋。

1.2.4 免疫组化染色制作4µm厚切片，裱片于涂有多聚赖氨酸的洁净载玻片上。60℃烤箱烤片120 min。二甲苯脱蜡：二甲苯液体Ⅰ脱蜡30 min，二甲苯液体Ⅱ脱蜡30 min。梯度乙醇水化：依次无水乙醇Ⅰ10 min，无水乙醇Ⅱ10 min，95%乙醇10 min，80%乙醇10 min；PBS（pH=7.4）冲洗3次，每次3min。抗原修复：使用微波炉修复法，取一定量的柠檬酸缓冲液（缓冲液量不少于500 mL）于微波盒中，微波加热直至沸腾，将脱蜡水化后的组织切片置于高温塑料切片架上，放入已沸腾的缓冲液中，中高档微波继续处理15～20 min，取出微波盒冷却至室温，从缓冲液中取出玻片，先用蒸馏水冲洗2次。PBS（pH=7.4）冲洗3次，每次3 min。灭活内源性过氧化物酶：3%双氧水在室温下孵育10 min。PBS（pH=7.4）冲洗3次，每次3 min。第一抗体孵育：甩去PBS液，并吸水纸吸除多余PBS液，滴加入兔抗肾上腺素α1受体（1∶500，abcom），兔抗肾上腺素α2受体（1∶500，abcam），5张切片上分别滴加PBS作为阴性对照，37℃恒温箱孵育1 h。PBS（pH=7.4）冲洗3次，每次3 min。生物素标记第二抗体孵育：甩去PBS液，并吸水纸吸除多余PBS液，滴加第二抗体（本抗体为即用型直接滴加盖过组织即可），室温下孵育30min，PBS（pH=7.4）冲洗3次，每次3 min。显色：滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察3～10 min，阳性显色为棕色。自来水冲洗终止显色，冲洗5 min。苏木精复染细胞核：苏木精复染5 min；自来水冲洗1 min。盐酸乙醇分化30 s。流水冲洗充分返蓝。切片通过梯度乙醇脱水：80%乙醇5 min，95%乙醇5 min，无水乙醇Ⅰ5 min，无水乙醇Ⅱ5 min。二甲苯：二甲苯液体Ⅰ透明5 min，二甲苯液体Ⅱ透明5 min。中性树胶封固，显微镜下观察并分析结果。

1.3 统计学分析应用图像分析仪（Quanti met 570c，Leica，Germany）采集图像。采用SPSS19.0软件进行统计分析，定量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，各组间的两两比较采用LSD法，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

光镜下肾上腺素α1、α2受体免疫反应阳性产物呈淡黄色或棕黄色颗粒染色，散在分布于3组大鼠下丘脑视前区。免疫组化显示，OVX组大鼠下丘脑视前区肾上腺素α1受体阳性黄染颗粒细胞数低于假手术组（P＜0.01），α2受体细胞数高于假手术组；（OVX+E2）组α1受体细胞数高于OVX组（P＜0.01），α2受体细胞数低于OVX组（P＜0.01）；而（OVX+E2）组与假手术组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1，图1。

表1 肾上腺素α1受体和肾上腺素α2受体在3组大鼠下丘脑视前区表达的阳性细胞数量（个/100µm2）Table 1 1 Number of positive cells expressing adrenergic α1and α2receptor in POAH of three groups of rats（cells/100µm2）

图1 大鼠下丘脑视前区肾上腺素α1受体和α2受体表达（免疫组化染色×200）Figure 1 Expression of adrenergic α2and α2receptor in POAH of three groups of rats（immunohistochemical×200）

3 讨 论

围绝经期潮热是以潮红和出汗为特征的快速和夸张的散热反应［4］。中心体温的微小上升即可触发潮热发生［14］。它不仅仅是围绝经期的典型症状而且可能是其他慢性疾病的征兆［15］。因此，了解潮热发生的机制，对处理缓解围绝经期潮热症状和改善围绝经期妇女们的生活质量以及预防其他疾病有重要意义。

潮热的发生可以理解为热敏感神经元在发挥着重要作用。潮热发生时，热敏感神经元发放冲动到体温调节中枢，由温度敏感神经元整合信息后发出散热信号，外周皮肤血管舒张血流量增加，机体可感觉烘热，外周血管扩张潮红，皮温升高出汗，而随后体温下降低于调定点水平，则中枢发出整合信息，引起产热增加，表现为发冷寒战的升温过程。体内雌激素水平的快速跌落，通过影响中枢神经递质（肾上腺素能受体，5-HT受体等）改变下丘脑体温调节中枢体温调定点正常生理调节机制，使其对于外围体温改变的反馈调节紊乱，使血管扩张散热，诱发潮热。围绝经期或去卵巢后体内雌激素水平下降，而雌激素治疗可缓解症状，因此可以理解为潮热可能是低雌激素状态下，POAH神经元温度敏感性增高引起的。

去甲肾上腺素是降低体温调定点和触发潮热的重要神经递。它通过抑制下丘脑体温体温调节中枢的热敏神经元或者兴奋冷敏神经元，导致产热过多或者散热不足，使体温上升［16］。尸体研究表明，大多数α2受体在人脑中是抑制性受体［17］。向下丘脑视前区注射α1受体拮抗剂哌唑嗪后，冷、热敏神经元的放电频率发生改变［18］。雌激素对肾上腺素受体具有调节作用［9，19-20］。综合这些现象进一步证明，围绝经期潮热发生的可能机制是卵巢功能衰竭，雌激素分泌迅速减少，脑内去甲肾上腺素升高，最终下丘脑体温调节中枢的热中性带变窄。去甲肾上腺素介导的热中性带变窄可能通过其相应的受体变化引起的。

本研究通过免疫组化方法观察了与体温调节关系密切的肾上腺素α1受体和α2受体在去卵巢大鼠下丘脑视前区的分布变化以及临床上治疗潮热最有效的雌激素类药物——戊酸雌二醇干预后该受体在大鼠下丘脑视前区的表达变化，试图阐明围绝经期潮热发生时体温调节紊乱所涉及的去甲肾上腺素通路机制。去甲肾上腺素对α2受体有高亲和性，而对α1受体和β受体的亲和性较低；它对体温调节中枢的温敏神经元放电活动的作用主要是由α1受体介导。

本研究观察到，去卵巢大鼠下丘脑视前区的肾上腺素α1受体减少，肾上腺素α2受体增多。我们推测，肾上腺素α1受体和肾上腺素α2受体均分布在热敏神经元上，肾上腺素α2受体改变热敏神经元对去甲肾上腺素反应的类型，导致散热不足或者过度散热。肾上腺素α1受体改变热敏神经元的放电活动，即改变热敏神经元的温度敏感性。当去卵巢大鼠POAH表达的肾上腺素α2受体增多，热敏神经元表现出受去甲肾上腺素抑制作用的类型为主，导致散热不足，体温升高。所以潮热发生前中心体温升高的现象不难解释，也表明肾上腺素α2受体与潮热的启动有关。去卵巢大鼠POAH表达的肾上腺素α1受体减少，热敏神经元放电活动减低，温度敏感性下降，导致散热机能减弱，出现体温调节异常。

戊酸雌二醇治疗后大鼠POAH区表达的上述两种受体发生了与OVX大鼠相反的结果。表明戊酸雌二醇治疗潮热症状的部分机制也是通过肾上腺素能受体完成的。有研究表明，雌激素撤退可致散热效应器的神经通路的敏感性增加，雌激素治疗去卵巢大鼠后热中性带会发生变化［5，21］。

结合本研究的结果，雌激素可能通过肾上腺素能受体直接或间接改变体温调节中枢的热中性带。α2受体激动剂可乐可以减少潮热发生的次数，并且增加了需要启动潮热的最高温度，说明α2受体提高了热阈值并且与潮热的启动有关。Karkanias等［22］发现切除卵巢后，雌性大鼠POAH神经元去甲肾上腺素α2受体的数量明显增加，而受体的亲和力不变。本研究结果与之基本一致。围绝经期妇女下丘脑视前区热中性带变窄很可能是由于肾上腺素α2受体数量增多引起的，换言之，大鼠去卵巢后，肾上腺素α2受体可以使热中性带的热阈值下降，导致热中性带变窄。肾上腺素α1受体降低POAH热敏神经元的温度敏感性，实现肾上腺素α2受体对热敏神经元功能的抑制。二者的作用相辅相成，使下丘脑视前区体温调节功能紊乱，主要是散热机制异常，导致潮热的发生。

我们前期工作观察了去卵巢大鼠下丘脑视前区与体温调节关系密切的5-HT受体的分布变化［9］。结合本次研究结果，进一步表明5-HT和去甲肾上腺素系统在围绝经期潮热发生中均扮演重要角色，这两种神经递质包括单胺类神经递质间形成复杂的神经递质网络，对体温进行精细调节。围绝经期潮热发生的中枢神经递质机制比较复杂，其确切机制尚需要进一步深入研究。