miR-182下调MTSS1表达促进三阴性乳腺癌侵袭及转移

于金玲，沈卫达，高蓓敏，赵海燕，秦 琛

0 引 言

三阴性乳腺癌（three-negative breast cancer，TNBC）是严重危害女性健康的恶性肿瘤［1］。TNBC根据癌细胞表现特性可分为4个亚型，分别为免疫调节型、腔面雄激素受体型、基底样免疫抑制型和间质型。不同亚型具有独特的基因突变位点，而这些基因突变位点的研究是临床基础研究的方向。由于TNBC存在分子生物学异质性，病理组织学分级差，肿瘤侵袭性强，易局部复发及远处转移，缺乏治疗靶点，预后极差，3年后复发率可达到40%～50%［2］。因此深入研究TNBC分子生物学转移机制，发现新的TNBC治疗靶点，开展针对性的精准靶向治疗，对提高TNBC的生存具有重要意义。

目前研究发现多种miRNA在乳腺癌中存在异常表达，与淋巴结转移及生存相关，并调控相应的靶基因参与乳腺癌的发生发展过程［3-4］。既往研究发现，miR-182在TNBC组织中高表达，促进乳腺癌细胞增殖及迁移，与TNBC复发和转移相关［5］。miR-182通过调控相应靶基因表达发挥促癌作用的机制尚未明确。通过生物信息学软件预测发现，miR-182与MTSS1有潜在靶结合位点。本研究进一步验证该结合位点，并探讨miR-182调控MTSS1表达对TNBC侵袭及转移的影响。

1 资料与方法

1.1 研究对象本研究获得上海长宁区妇幼保健院伦理委员会批准（批准号CNFBLLQKW-2016003），所有患者均知情同意。入选2010年1月至2015年12月期间上海市长宁区妇幼保健院收治的30例TNBC患者，收集其石蜡包埋的癌及癌旁组织。所有患者均在该院施行乳腺癌改良根治术；发病年龄30～70岁，中位发病年龄50.1岁；未绝经12例、已绝经18例；淋巴结阳性组13例、阴性组17例；肿瘤病理分期Ⅰ期及Ⅱ期共24例，Ⅲ期6例。入选标准：所有病例术前均未接受过放疗及化疗，全部标本经组织病理学证实为浸润性导管癌。如同侧腋窝淋巴结转移＞3枚或肿瘤直径＞5 cm者术后给予放疗。排除标准：术前接受过放疗及新辅助化疗者；有远处转移患者；特殊病理类型乳腺癌。

1.2 材料与试剂MCF-7低转移细胞株、MDA-MB-231高转移细胞株购自中国上海中科院细胞库；DMEM培养基购自美国Gibco公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；CCK8试剂购自日本同仁化工；RNA逆转录试剂盒购自日本Takara公司。

1.3 仪器与设备生物安全柜购自德国Thermo公司；二氧化碳培养箱购自德国Thermo；荧光显微镜购自日本Nikon公司；Milli-Q超纯水制备系统购自德国Millipore公司；细胞培养皿购自美国CORNING-Costar公司；酶标仪购自德国PerkinElmer公司。

1.4 蜡块组织中提取RNA及荧光定量PCRTNBC石蜡包埋组织切成≥20µm的薄片，取≤80µm石蜡组织，用于常规脱蜡和蛋白酶消化。根据石蜡组织提取试剂盒的说明，用离心柱洗脱总RNA。测定RNA溶液A260/A280吸光度值，并计算其浓度和纯度。A260/A280比值在1.8～2.1之间可用于cDNA的合成。2%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性，RNA在-80℃保存。Trizol抽取总RNA，并用RNA逆转录试剂盒（Takara公司，日本）进行逆转录，采用 Sybr GreenMaster Mix（Takara公司，日本）进行定量PCR。以GAPDH作为标准化参照，使用ΔΔCT法计算不同基因的相对表达。

1.5 细胞侵袭和迁移实验在MCF-7细胞分为Si-MTSS1组与SiNC组，在MCF-7细胞中沉默MTSS1表达；MDA-MB-231细胞分为pcDNA3.1-MTSS1组与pcDNA3.1 NC组，在MDA-MB-231细胞过表达MTSS1。将MCF-7和MDA-MB-231细胞分别接种于24孔细胞培养板中，1×105细胞/孔。18 h后MCF-7转染Si-MTSS1为实验组，SiNC为对照组；高转移乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞转染pcDNA3.1-MTSS1为实验组，pcDNA3.1 NC为对照组，每组3个重复。lipofectamineRNAiMAX的用量为0.25µL/孔，RNA的用量为5 pmol/孔，6 h后换液，继续培养。转染24 h后，Matrigel胶和DMEM培养基按1︰3的比例混合后每孔上室加入20µL，放入37℃培养箱静置30 min使胶凝结。将转染后的MDA-MB-231和MCF-7细胞消化打散，取100 000个细胞，加入transwell小室上层，总体积为100µL，不含血清，每组用3个小室。小室下层中加入600µL含有10%血清的培养基。48 h后将小室用4%多聚甲醛固定，然后将上层膜的细胞轻轻擦除，下层膜的细胞用DAPI染色。将染色后的下层膜的细胞置于荧光显微镜下拍照，每个小室随机选取5个视野，20倍物镜。对每张照片中的细胞数进行统计。

1.6 荧光素酶报告基因实验及突变实验通过网站 http：//www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/查询MTSS1基因的3′UTR序列存在3个目的基因片段（262-268，1083-1089，1928-1935）为miR-182潜在结合位点，分别命名为MTSS1-U1、MTSS1-U2和 MTSS1-U3。其中，MTSS1-U2（1083-1089）的靶点为：UUGGAGUCUAGCAACUUGCCAAU；U替换为T后：TTGGAGTCTAGCAACTTGCCAAT；合 成 引 物 ：MTSS1-U2-FP：5'CTAGTCTAGAATCTCCCACTTCAGTTTCTCGT3'；MTSS1-U2-RP： 5' GGGAATTCCATATGCCCAGAATACAAAAAAAGGACAG 3'。

根据has-miR-182靶点预测信息，将MTSS1基因的3个预测靶点分别构入荧光素酶报告基因质粒PGL3-3'UTR中，将构建成功的荧光素酶报告基因质粒与miR-182 mimics共转染至低转移乳腺癌细胞系MCF-7，通过酶标仪检测荧光素酶活性是否降低。具体过程如下：将MCF-7细胞接种于48孔板。细胞铺板后24 h，使用Poly-Fecter转染试剂进行转染，每孔用量如下：has-miR-182 mimics 100 ng，Luc-UTR报告基因质粒100 ng，内参Renilla 5 ng（证明转染成功，并用作数据归一化处理）。以阴性参照siRNA（NC）100 ng加Luc-UTR报告基因质粒100 ng，内参Renilla 5 ng为对照组实验。每组设置3个重复孔。6 h后换液；转染后48 h裂解细胞，测试luciferase活性，测试结果为PerkinElmer酶标仪读取的吸光度值。

将包含has-miR-182靶点的MTSS1相应靶点序列突变，并将构建成功的荧光素酶报告基因突变质粒与miR-182 mimics共转染至低转移乳腺癌细胞系MCF-7，通过酶标仪检测荧光素酶活性是否恢复，进一步明确miRNA的结合位点。

1.7 细胞内源基因表达量检测MCF-7细胞转染miR-182，对照组转染SiNC。24～48 h后提取RNA，通过RT-qPCR检测MTSS1 mRNA表达量变化；48～72 h后提取蛋白，通过Western blot检测MTSS1蛋白表达量变化。

1.8 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用配对t检验。TNBC组织中miR-182与MTSS1表达根据数据分布采用Spearman相关性检验。以P≤0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-182及MTSS1在TNBC癌组织的相对含量qPCR结果显示，TNBC组织中miR-182相对定量表达明显高于癌旁组织［（5.618±2.767）vs（1.315±0.403）］，差异有显著统计学意义（t=-8.409，P=0.000）；MTSS1癌组织中表达明显低于癌旁组织［（0.130±0.009）vs（0.370 ± 0.667）］，差异有统计学意义（t=2.961，P=0.006），见图1。MTSS1在淋巴结阳性组表达（0.005±0.003）明显低于淋巴结阴性组（0.015±0.009），差异有统计学意义（t=3.418，P=0.004）。Spearman相关性检验结果表明，TNBC癌组织中miR-182与MTSS1相对表达呈显著负相关（r=-0.433，P=0.017）。

图1 miR-182及MTSS1在TNBC组织中相对定量表达Figure 1 Relative quantitative expressions of miR-182 and MTSS1 in the triple-negative breast cancer tissue

2.2 miR-182及MTSS1对乳腺癌细胞侵袭和迁移的影响转染miR-182的MCF-7细胞胶穿和空穿数量明显增多，与对照组相比差异有统计学意义（t=18.400，P=0.003）；转染 Antagomir-182的 MDA-MB-231细胞胶穿和空穿数量明显减少，与对照组相比差异有统计学意义（t=-41.065，P=0.001）。

在MCF-7细胞中，Si-MTSS1组与SiNC组相比，发生迁移的细胞数量增多，差异有统计学意义（t=-15.323，P=0.004），提示MTSS1敲低促进了乳腺癌细胞的迁移。在MDA-MB231细胞中，pcDNA3.1-MTSS1组与pcDNA3.1组相比，发生迁移的细胞数量减少，差异有统计学意义（t=27.114，P=0.001），提示MTSS1过表达抑制了乳腺癌细胞的迁移。见图2。

图2MTSS1对MCF-7及MDA-MB-231迁移的影响Figure 2 Migration and invasiveness of MTSS1 in the MCF-7 and MDA-MB-231 cells

2.3 荧光素酶报告基因实验及突变实验荧光素酶报告基因实验发现，将质粒MTSS1-U2分别与miR-182 mimics共转染至低转移乳腺癌细胞系MCF-7，其荧光素酶活性降低较为明显，差异有统计学意义（t=18.383，P=0.006），见图 3。结果表明MTSS1基因的1083-1089靶点（U2）为has-miR-182的结合靶点。与包含miR-182靶点的3′UTR相比，突变靶点后的3′UTR的luciferase活性更低，即mut-MTSS1-U2包含miR-182的靶点，进一步证明了miR-182的结合位点与预测相符合。

图3 双荧光素酶验证MTSS1-U2为miR-182结合靶点Figure 3 MTSS1-U2 confirmed to be the target binding site of miR-182 by dual luciferase assay

2.4 内源基因表达量检测结果与对照组比较，qPCR结果表明，MCF-7中转染miR-182后MTSS1在mRNA水平明显降低，差异有统计学意义（t=-5.918，P=0.027），见图 4。Western blot结果发现，MCF-7中转染miR-182后MTSS1抗体检测在34kd处检测到微弱条带，见图5。

图4miR-182过表达MTSS1mRNA水平变化Figure 4 Relative expression of MTSS1 mRNA in the MCF-7 cells transfected with miR-182

图5 miR-182过表达MTSS1蛋白水平变化Figure 5 Relative expression of the MTSS1 protein in the MCF-7 cells transfected with miR-182

3 讨 论

TNBC严重危害女性健康，占所有乳腺癌发病的10%～30%，其复发率3年后可达到40%～50%。TNBC存在分子生物学异质性，具有侵袭性强、复发早、预后差、远处转移率高等特点，且缺乏内分泌及抗HER-2治疗靶点，仍是乳腺癌治疗的难点和热点［1，6］。

乳腺癌的发病是一个多基因突变积累的过程［7］。微小RNA（miRNA）是一类非编码单链RNA，具有18～25个核苷酸，成熟的miRNA在5′端带有磷酸基团，可通过与靶基因3′端非翻译区互补结合，引起靶基因mRNA的降解或翻译抑制，参与肿瘤侵袭及转移过程。近年来研究证实，多种miRNA在乳腺癌中存在异常表达，并调控其下游靶基因参与乳腺癌的发生发展过程［3-4］。Liu 等［8］研究发现miR-182过表达促进卵巢癌的侵袭及转移。张曙光等［9］发现MTSS1表达上调与食管癌淋巴结转移呈负性相关，且可抑制食管鳞癌细胞的侵袭及迁移发生。Fan等［10］认为MTSS1在肝细胞癌中起肿瘤抑制作用。Vadakekolathu等［11］研究发现MTSS1可增加乳腺癌细胞间粘附作用，抑制乳腺癌转移。既往研究提示miR-182及MTSS1可能在肿瘤发生发展过程中发挥重要生物学作用［12］；但均未进一步探讨其内在机制。Xie等［13］发现miR-96可通过抑制MTSS1促进乳腺癌转移。然而目前尚未有研究报道TNBC患者miR-182与MTSS1作用机制关系。

既往研究发现miR-182在TNBC癌组织高表达，与临床分期及淋巴结转移相关，MCF-7细胞中过表达miR-182可促进乳腺癌细胞增殖及迁移［14］。进一步研究发现miR-182可与FOXF2靶向结合，下调其表达，促进乳腺癌侵袭及迁移，可能是TNBC潜在的治疗靶点［5］。本研究中MTSS1在TNBC癌组织中表达明显低于癌旁组织，在TNBC淋巴结阳性组表达更低，MDA-MB-231细胞中过表达MTSS1可抑制乳腺癌细胞侵袭及迁移。这提示MTSS1可能参与了三阴性乳腺癌的发生发展过程，并可能受到miR-182的调控作用。荧光素酶报告基因实验证实了MTSS1基因的1083-1089靶点为miR-182的结合靶点；miR-182通过与该靶点靶向结合，导致MTSS1在mRNA及蛋白水平表达均降低。提示miR-182通过下调MTSS1表达，促进TNBC侵袭及转移。进一步的荧光素酶报告基因实验及突变实验验证发现，在MTSS1的3′UTR端1083-1089靶点为miR-182的结合靶点。通过qPCR技术研究发现，MCF-7中转染miR-182后，MTSS1表达量下降。提示miR-182可与MTSS1靶向结合，下调其表达，在TNBC发生发展过程中发挥促癌作用；该靶结合位点可能是TNBC治疗的潜在靶点。

本研究的局限之处在于尚缺乏体内动物实验，进一步阐明miR-182及MTSS1的调控机制。miR-182/MTSS1信号通路对TNBC复发、转移的影响，有待进一步研究。

综上所述，TNBC发生发展过程中受多种因素影响，miRNA异常表达可能是其中因素之一［15］。作为一种异质性疾病，TNBC较其他分子分型的乳腺癌侵袭性更强，更容易复发转移，目前尚缺乏有效的治疗手段［16］。TNBC转移的生物学发生发展机制，目前尚未完全明确。其潜在的分子治疗靶点探索有望为TNBC患者带来新的治疗机会。