岩白菜素衍生物合成方法及抗肿瘤活性评价

杨彦霞，庄方方，闫福林

(1.新乡医学院第三附属医院药学部，河南 新乡 453003；2.河南省职工医院药学部，河南 郑州 450001；3.新乡医学院药学院，河南 新乡 453003)

岩白菜素是一类二氢异香豆素类化合物，是传统中药岩白菜(Bergenialigulata)[1]的主要活性成分，也存在于其他植物中，如鬼灯檠(RodgersiaaesculifoliaBatal.)[2]。作者在对天然植物鬼灯檠进行化学成分研究中得到了大量的岩白菜素。岩白菜素有多种药理活性，如降血脂[3]、抗人类免疫缺陷病毒[4]、抗炎[5]、抗心律失常[6]、神经保护[7]、肝脏保护[8]和胃肠道保护[9]等。而对岩白菜素的抗肿瘤活性研究较少。1，2，3-三氮唑及其衍生物由于具有广法的生物活性而一直备受关注[10]，有研究报道其具有抗肿瘤药理活性[11]。基于三氮唑的抗肿瘤药理活性，本研究拟以岩白菜素为初始原料，首先在分子结构中引入炔烃，然后通过Click反应[12]引入1，2，3-三氮唑基团，制备含活性基团三氮唑的岩白菜素衍生物，并采用甲基噻唑基四唑法(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)检测制备的衍生物对胃癌MGC-803细胞、食管癌EC9706细胞、黑色素瘤B16细胞的体外抗肿瘤活性。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂与仪器人食管癌EC9706细胞、胃癌MGC-803细胞及黑色素瘤B16细胞购自广州吉妮欧生物科技有限公司；溴化苄、4-乙基氯化苄购自美国Sigma Aldrich公司，4-叔丁基氯苄购自阿拉丁试剂(上海)有限公司，氟尿嘧啶(fluorouracil，FU)购自山东普德有限公司，柱层析用石油醚、乙酸乙酯(ethyl acetate，EA)购自天津科密欧试剂公司，达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)、胎牛血清购自杭州四季青生物技术公司，MTT试剂盒、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)购自美国Sigma公司；柱层析用硅胶(200～300目)、薄层层析用硅胶GF254购自青岛海洋化工厂，Bruker-400型核磁共振波谱仪购自德国Bruker公司，FTS-40红外光谱仪购自美国Bio-Rad公司，X-4显微熔点仪(温度计未校正)购自上海精密仪器有限公司，Q-TOF 6540高分辨质谱仪购自美国安捷伦公司。

1.2 岩白菜素衍生物的制备步骤1：取岩白菜素(32.8 mg，0.1 mmol)、3-溴丙炔 (35.7 mg，0.3 mmol)、KI (49.8 mg，0.2 mmol)、K2CO3(27.6 mg，0.2 mmol) 溶解于N-甲基吡咯烷酮(N-methyl-2-pyrrolidone，NMP)中，60 ℃反应 4 h。薄层色谱法(thin-layer chromatography，TLC)检测，反应结束后冷却至室温，有机相用EA萃取3次，萃取液用过量的Na2SO4粉末干燥15 min，过滤、减压浓缩得粗产品，粗产品经硅胶柱层析分离纯化，在石油醚(petroleum ether，PE)和EA不同比例(PE：EA，1：1、0：1)下洗脱，得到纯净产物1(图1)。

步骤2：取1 mmol溴化苄与2 mmol叠氮化钠于5 mL干燥圆底烧瓶中，加入2 mL二甲基甲酰胺(N，N-Dimethylformamide，DMF)，30 ℃下反应10 h，TLC检测反应，反应结束后向反应液中缓慢加入 10 mL 乙醚和10 mL蒸馏水温和条件下进行萃取，有机相用过量的无水Na2SO4干燥15 min，过滤，浓缩得到苄基取代的叠氮化合物(图1)。

步骤3：取中间产物1 (40.2 mg，0.1 mmol)、苄基取代的叠氮化合物(0.25 mmol)、CuSO4·5CuSO4·5H2O(5 mg)、和维生素C钠(5 mg)于3 mL THF-H2O(v/v=1/1) 或者3 mLt-BuOH-H2O(v/v=1/1)反应溶剂中，40 ℃条件下反应4 h，TLC检测反应。结束后反应溶液冷却至室温，有机相用EA萃取3次，萃取液用过量的Na2SO4粉末干燥15 min，过滤、减压浓缩得粗产品，粗产品经硅胶柱层析分离纯化，在PE和EA不同比例(PE：EA，5：1、3：1)下洗脱，得到目标产物2(图1)。

化合物3～8的制备方法(图1)同化合物2，区别于中间产物1与不同的叠氮化合物进行Click反应。

a：3-溴丙炔，KI，K2CO3，NMP，60 ℃，66.7%；b：NaN3，DMF，30 ℃；c：CuSO4·5H2O，维生素C钠，THF-H2O或者 t-BuOH-H2O，40 ℃，产率74.4%～96.3%。

1.3 岩白菜素及其衍生物的抗肿瘤活性检测

1.3.1 细胞培养人胃癌MGC-803细胞，食管癌EC9706细胞及黑色素瘤B16细胞置于含体积分数10% 胎牛血清的DMEM 完全培养基，于37 ℃、含体积分数5% CO2的恒温培养箱中培养，正常传代3次后将细胞置于含体积分数10%胎牛血清、0.01 U·L-1链霉素与0.10 U·L-1青霉素的DMEM培养液中，于37 ℃、含体积分数5% CO2的恒温培养箱中饱和湿度培养，每2 ～ 3 d换液1次。

1.3.2 MTT法测定岩白菜素及合成的8种化合物的半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration，IC50)分别取对数生长期、状态良好的胃癌MGC-803细胞、食管癌EC9706细胞及黑色素瘤B16细胞，制成单细胞悬液，细胞密度调整为1×102L-1，接种在96孔板，每孔加细胞悬液100 μL，置于37 ℃、含体积分数5%CO2的恒温培养箱中培养24 h，细胞贴壁后，将细胞分为给药组、对照组和空白组。给药组按照预定的浓度梯度分别加入岩白菜素及合成的8种衍生物待测样品，每个梯度做6个重复。对照组细胞给予等体积的用于溶解样品用的溶剂，空白组细胞给予三蒸水，培养48 h后，每孔加入20 μL MTT，置于37 ℃、含体积分数5%的CO2培养箱中温育4 h，弃上清液，每孔加入200 μL DMSO，震荡10 min，沉淀溶解，用酶标仪在492 nm波长处检测吸光度值，计算样品对细胞的抑制率；采用氟尿嘧啶为阳性对照。抑制率=[(对照组吸光度值-空白组吸光度值)-(给药组吸光度值-空白组吸光度值)]/(对照组吸光度值-空白组吸光度值)×100%，以抑制率为横坐标，药物浓度为纵坐标作图，计算每个样品的IC50，IC50≤100 μmol·L-1为有肿瘤细胞抑制作用，IC50>100 μmol·L-1为无肿瘤细胞抑制作用。本实验连续测定3次，取均值。

2 结果

2.1 衍生物1～8的结构特征化合物1：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-8，10-bis(prop-2-yn-1-yloxy)-2，3，4，4a-tetrahydropyrano[3，2-c]isochromen-6(10bH)-one，产率：66.7%，白色固体，m.p.180～182 ℃，IR (cm-1) 3 399，3 284，2 123，1 698，1 328，1 121，1 030；1H NMR (400 MHz，DMSO-d6，ppm，TMS) δ 7.50 (s，1H)，5.61 (d，J=5.8 Hz，1H)，5.32 (d，J=5.2 Hz，1H)，4.95 (s，2H)，4.86 (d，J=10.4 Hz，1H)，4.71 (q，J=15.7 Hz，2H)，4.52 (s，1H)，3.93 (t，1H)，3.87 (s，3H)，3.66 (s，2H)，3.54 (s，2H)13C NMR (100 MHz，DMSO-d6，ppm，TMS) δ 163.5，150.7，148.9，148.5，127.4，118.9，111.6，81.5，80.2，79.9，79.1，78.7，77.9，74.1，71.2，70.2，60.9，60.9，60.9，56.6。C20HO9(M+Na)+高分辨质谱 (high-resdution mass spectrometer，HRESIMS)计算值427.099 9，实测值427.099 9。

化合物2：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-8，10-bis((1-benzyl-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methoxy)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-2，3，4，4a-tetrahydro-pyrano[3，2-c]isochromen-6(10bH)-one，产率 86.9%，白色粉末，m.p.105～106 ℃，IR (cm-1) 3 400，3 289，2 925，1 717，1 327，1 103，1 030；1H NMR (400 MHz，DMSO-d6，ppm，TMS) δ 8.31 (s，1H)，8.28 (s，1H)，7.57 (s，1H)，7.41-7.26 (m，10H)，5.64 (s，2H)，5.62 (s，2H)，5.35 (d，J=5.5 Hz，1H)，5.26 (s，2H)，5.08 (q，J=11.3 Hz，2H)，4.89 (t，J=5.8 Hz，1H)，4.77 (d，J=10.3 Hz，1H)，4.03 (q，J=7.1 Hz，1H)，3.92 (t，J=9.9 Hz，1H)，3.73 (s，3H)，3.38 (s，2H)。13C NMR (100 MHz，DMSO-d6，ppm，TMS) δ 163.6，151.6，149.3，148.5，143.6，142.6，136.2，136.1，128.9，128.8，128.3，128.2，128.0，127.9，125.1，124.9，119.1，111.6，82.0，80.4，74.1，71.4，70.2，66.2，62.3，60.9，60.7，59.9，52.9。C34HN6O9(M+Na)+HRESIMS计算值693.227 9，实测值 693.227 3。

化合物3：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-8，10-bis((1-(4-ethylbenzyl)-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methoxy)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-2，3，4，4a-tetrahydropyrano[3，2-c]isochromen-6(10bH)-one，产率：91.3%，无色油状物，IR (cm-1) 3 380，1 717，1 321，1 103，1 023；1H NMR (400 MHz，CD3OD，ppm，TMS) δ 8.03 (s，1H)，7.97 (s，1H)，7.53 (s，1H)，7.20-7.15 (m，8H)，5.61 (d，J=11.3 Hz，1H)，5.53 (s，2H)，5.50 (s，2H)，5.19 (s，2H)，5.06 (d，J=11.4 Hz，1H)，4.53 (d，J=10.2 Hz，1H)，3.91-3.82 (m，2H)，3.77 (s，3H)，3.41 (t，J=6.7 Hz，2H)，3.35 (s，2H)，2.60 (q，J=7.6 Hz，4H)，1.18 (t，J=7.6 Hz，6H)。13C NMR (100 MHz，CD3OD，ppm，TMS) δ 165.7，153.5，151.1，150.5，146.4，146.4，145.3，144.7，134.3，134.2，130.5，129.8，129.9，129.5，129.4，126.2，125.9，120.6，114.2，83.3，82.0，76.1，73.5，71.6，67.2，63.8，62.6，61.9，55.0，55.0，29.7，29.7，16.3，16.3。C38HN6O9(M+Na) HRESIMS计算值749.290 5，实测值 749.290 6。

化合物4：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-8，10-bis((1-(4-(tert-butyl)benzyl)-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methoxy)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-2，3，4，4a-tetrahydropyrano[3，2-c]isochromen-6(10bH)-one，产率：80.8%，黄色粉末，m.p.121～123 ℃，IR (cm-1) 3 380，2 961，1 722，1 321，1 103，1 023；1H NMR (400 MHz，Acetone，ppm，TMS) δ 8.18 (s，2H)，7.60 (s，1H)，7.40 (dd，J=8.5，3.4 Hz，4H)，7.28 (dd，J=13.5，8.5 Hz，4H)，5.60 (s，4H)，5.28 (s，2H)，5.17 (d，J=10.8 Hz，1H)，5.07 (d，J=10.8 Hz，1H)，4.70 (d，J=10.3 Hz，1H)，3.97-3.91 (m，2H)，3.81 (s，3H)，3.76 (dd，J=12.5，5.0 Hz，1H)，3.48 (d，J=7.9 Hz，1H)，3.41 (s，2H)，1.27 (s，18H)。13C NMR (100 MHz，Acetone，ppm，TMS) δ 163.8，152.3，151.4，149.5，149.4，143.9，143.3，133.2，133.1，128.1，128.0，127.9，125.9，125.9，125.0，124.5，119.6，112.4，82.5，80.8，74.8，72.2，70.6，66.3，62.8，61.4，60.8，53.4，53.3，34.4，30.9。C42HN6O9(M+Na)+HRESIMS计算值805.353 1，实测值805.352 3。

化合物5：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-8，10-bis((1-(4-fluorobenzyl)-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methoxy)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-2，3，4，4a-tetrahydropyrano[3，2-c]isochromen-6(10bH)-one，产率：96.3%，白色粉末，m.p.117～119 ℃，IR (cm-1) 3 380，2 961，1 722，1 321，1 127，1 023；1H NMR (400 MHz，Acetone，ppm，TMS) δ 8.23 (s，1H)，8.22 (s，1H)，7.58 (s，1H)，7.48-7.38 (m，4H)，7.14 (ddd，J=8.8，6.0，3.4 Hz，4H)，5.66 (s，2H)，5.65 (s，2H)，5.29 (s，2H)，5.20-5.03 (m，2H)，4.70 (d，J=10.3 Hz，1H)，4.04 (q，J=7.1 Hz，1H)，3.96 (t，J=7.6 Hz，1H)，3.94-3.90 (m，1H)，3.82 (s，3H)，3.75 (dd，J=12.5，5.0 Hz，1H)，3.42 (s，2H)。13C NMR (100 MHz，Acetone，ppm，TMS) δ 163.9，163.7，161.5，152.2，149.5，149.3，143.9，143.3，132.3，130.6，130.6，130.5，130.5，127.9，124.9，124.5，119.5，115.9，115.9，115.7，115.7，112.3，82.4，80.7，74.7，72.1，70.5，66.2，62.6，61.4，60.7，52.9，52.8。C34H32F2N6O9(M+Na)+HRESIMS计算值729.209 1，实测值729.206 4。

化合物6：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-8，10-bis((1-(4-nitrobenzyl)-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methoxy)-2，3，4，4a-tetrahydropyrano [3，2-c]isochromen-6(10bH)-one，产率：74.4%，白色粉末，m.p.141～143 ℃，IR (cm-1) 3 368，1 717，1 522，1 346；1H NMR (400 MHz，DMSO-d6，ppm，TMS) δ 8.37 (s，1H)，8.34 (s，1H)，8.25 (d，J=2.4 Hz，2H)，8.23 (d，J=2.4 Hz，2H)，7.57 (s，1H)，7.52 (t，J=9.1 Hz，4H)，5.83 (s，2H)，5.81 (s，2H)，5.59 (d，J=5.2 Hz，1H)，5.30 (s，3H)，5.09 (q，J=11.4 Hz，2H)，4.79 (d，J=2.8 Hz，1H)，3.92 (t，J=9.9 Hz，1H)，3.76 (s，2H)，3.65 (dd，J=13.9，8.8 Hz，1H)，3.60-3.53 (m，1H)，3.33 (s，2H)。13C NMR (100 MHz，DMSO-d6，ppm，TMS) δ 163.5，151.6，149.3，148.5，147.4，147.3，143.7，143.5，143.4，142.8，129.1，129.0，127.3，125.4，125.3，124.0，119.1，111.6，82.0，80.3，74.1，71.3，70.2，66.2，62.3，60.9，60.8，52.0。C34H32N8O13(M+Na)+HRESIMS计算值783.198 1，实测值 783.196 8。

化合物7：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-8，10-bis((1-isopentyl-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methoxy)-9-methoxy-2，3，4，4a-tetrahydropyrano[3，2-c]isochromen-6(10bH)-one，产率：76.5%，无色油状物，IR (cm-1) 3 369，2 956，1 722，1 321，1 103，1 030；1H NMR (400 MHz，CD3OD，ppm，TMS) δ 8.14 (s，1H)，8.09 (s，1H)，7.59 (s，1H)，5.26 (s，2H)，5.18 (d，J=11.1 Hz，1H)，5.09 (d，J=11.2 Hz，1H)，4.69 (d，J=10.4 Hz，1H)，4.44 (dd，J=16.3，7.6 Hz，4H)，4.01-3.94 (m，1H)，3.87 (s，3H)，3.82-3.74 (m，2H)，3.46 (dd，J=15.5，7.5 Hz，1H)，3.30 (s，2H)，1.84-1.73 (m，4H)，1.49 (ddd，J=18.2，13.4，6.7 Hz，2H)，0.95 (t，J=6.3 Hz，12H)。13C NMR (100 MHz，CD3OD，ppm，TMS) δ 165.8，153.6，151.0，150.7，145.0，144.3，129.2，126.1，125.9，120.6，113.8，83.5，82.1，76.2，73.6，71.7，67.5，63.8，62.6，62.0，50.1，50.0，40.4，40.3，26.9，26.7，22.8，22.7。C30H42N6O9(M+Na)+HRESIMS计算值653.290 5，实测值 653.289 9。

化合物8：(2S，3R，4R，4aS，10bR)-8，10-bis((1-hexyl-1H-1，2，3-triazol-4-yl)methoxy)-3，4-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-9-methoxy-2，3，4，4a-tetrahydr-opyrano[3，2-c] isochromen-6(10bH)-one，产率：87.8%，白色粉末，m.p.103～105 ℃，IR (cm-1) 3 314，2 931，1 722，1 328，1 103，1 036；1H NMR (400 MHz，CD3OD，ppm，TMS) δ 8.12 (s，1H)，8.09 (s，1H)，7.62 (s，1H)，5.28 (s，2H)，5.19 (d，J=11.1 Hz，1H)，5.12 (d，J=11.2 Hz，1H)，4.73 (d，J=10.4 Hz，1H)，4.42 (q，J=7.3 Hz，4H)，4.03-3.92 (m，2H)，3.88 (s，3H)，3.83-3.79 (m，1H)，3.48 (d，J=7.9 Hz，1H)，3.32 (s，2H)，1.96-1.84 (m，4H)，1.30 (dd，J=13.1，10.9 Hz，12H)，0.89 (dd，J=8.7，4.3 Hz，6H)。13C NMR (100 MHz，CD3OD，ppm，TMS) δ 165.8，153.6，151.0，150.8，145.0，144.3，129.2，126.1，125.9，120.7，113.9，83.5，82.1，76.2，73.6，71.7，67.5，63.8，62.6，62.0，51.7，51.6，32.5，31.5，31.5，27.4，23.8，14.6。C32H46N6O9(M+Na)+HRESIMS计算值681.321 8，实测值681.319 5。

2.2 岩白菜素及其衍生物的体外抗肿瘤活性结果见表1。岩白菜素无抗肿瘤活性，其1，2，3-三氮唑衍生物中苯环、脂肪环的引入均能提高岩白菜素的抗肿瘤活性。尤其是苯环对位被吸电子基及空间位阻比较大的叔丁基取代的衍生物4对食管癌EC9706细胞抑制活性较好。

表1 岩白菜素及其衍生物的体外抗肿瘤活性

3 讨论

为了提高岩白菜素的抗肿瘤活性，本实验建立了在岩白菜素分子结构中引入活性基团三氮唑的合成方法，并对合成的衍生物进行抗肿瘤活性的评价。

本研究结果显示，中间产物炔烃化合物1对食管癌EC9706细胞显示出明显的抑制活性，岩白菜素的1，2，3-三氮唑衍生物的抗肿瘤活性明显强于岩白菜素。其中，1，2，3-三氮唑衍生物上取代基R在抗肿瘤活性方面起重要的作用，并且岩白菜素衍生物结构中苯环上取代基的电子属性及空间位阻也不同程度的影响其抗肿瘤活性，如苯环对位上含有给电子基团如4-CH2CH3和4-C(CH3)3(化合物3和4)或者含有吸电子基团如4-F和4-NO2(化合物5和6)的衍生物的抗肿瘤活性明显优于苯环对位上无取代基的衍生物(化合物2)，尤其是苯环对位上含4-C(CH3)3空间位阻比较大的衍生物(化合物4)，对胃癌MGC-803细胞、食管癌EC9706细胞和黑色素瘤B16细胞的抑制活性明显强于岩白菜素，IC50分别低至12.0、6.2、17.6 μmol·L-1，对食管癌EC9706细胞的抑制活性优于阳性对照药品氟尿嘧啶(IC50为6.3 μmol·L-1)。用脂肪链取代苯环的衍生物(化合物7，8)，其抗肿瘤活性明显强于岩白菜素，但与苯环取代衍生物相比，其抗肿瘤活性无明显增强。