青贮饲用油菜对育肥期山羊瘤胃发酵参数及微生物多样性的影响

赵娜，杨雪海，陈芳，郭万正，李晓峰，魏金涛*，陈明新，周广生，傅廷栋，谭志平

(1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，湖北 武汉 430064；2.华中农业大学植物科学技术学院，湖北 武汉 430070；3.湖北省恩施州巴东县信陵镇畜牧兽医服务中心，湖北 恩施 444399)

近年来，中国草食动物养殖业快速发展，伴随而来的是饲草需求持续增加，供给矛盾显现，尤以冬春季节缺口更为明显。油菜(Brassicacampestris)易越冬，种植成本低、生物产量大、蛋白和脂肪含量高[1]，中国南北地区都适宜种植，可以缓解冬春季节饲草不足的矛盾。近年来，饲用油菜相关研究逐渐得到重视，且已有数个饲用双低油菜品种如华油杂62、饲油1号、饲油36号等[2-3]。杨雪海等[4]研究了不同生长阶段的油菜饲用营养价值。刘彦培等[5]报道了结实期全株油菜及油菜秸秆的混合青贮技术，青贮方式能较好保存油菜及其秸秆，且增强其适口性。王亚犁[6-7]研究了饲用油菜复合青贮育肥秦川牛、滩羊等，动物体增重效果明显。饲用油菜经青贮后适口性更好，但其对反刍动物瘤胃发酵参数及菌群结构的影响尚未见报道。青贮玉米是反刍动物养殖中常用的饲料原料，从品种培育、青贮技术、青贮品质、微生物菌落等方面得到了广泛研究[8-12]，其适口性较好，对羊有较好的饲养效果[13]。本试验以青贮全株玉米(Zeamays)为对照，研究青贮饲用油菜对山羊瘤胃发酵参数、瘤胃菌群结构的影响，为饲用油菜在肉羊生产中的应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

青贮饲用油菜：品种为华油杂62，收割时期为结荚初期。青贮后外观为青黄色，具有酸香气味。风干样中粗蛋白质(crude protein，CP)、中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)含量分别为11.35%、47.11%和33.80%。

青贮全株玉米：品种为雅玉8号，收割时期为蜡熟期。青贮后外观为青黄色，具有酸香气味。风干样中粗蛋白质、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量分别为13.10%、58.62%和35.71%。

1.2 青贮方法

将收割后经晾晒、粉碎、揉丝的饲用油菜或全株玉米分别用ZL 5552型青贮打捆包膜一体机进行打捆成圆柱形青贮捆，每捆50 kg左右，置于水泥地面遮雨棚下存放60 d后备用。

1.3 试验动物与试验饲粮

将3月龄左右、体重(14.83±0.32) kg、健康的宜昌白山羊24只(公母各半)，随机分为2组，每组4个重复，每个重复3只羊。试验组饲喂含有青贮饲用油菜的全混合饲粮，对照组饲喂含有青贮全株玉米的全混合饲粮(表1)，预试期7 d，正试期90 d。

1.4 饲养管理

饲养试验于2016年9月至12月在湖北省宜昌市农业科学研究院宜昌白山羊保种繁育场进行。试验羊全舍饲饲养，佩戴耳号，预试前驱虫、免疫。试验期间自由采食，自由饮水。

1.5 试验方法

1.5.1生产性能测定 每天准确称量记录各处理组的饲料投放量及剩余量。分别于试验开始及结束当天晨饲前逐只称量试验羊空腹体重。计算干物质采食量(dry matter intake，DMI)、平均日增重(average daily gain，ADG)、料重比(feed to gain ration)等指标。

1.5.2瘤胃内容物的采集与处理 在正饲期最后一天，每组屠宰6只羊。试验羊只屠宰后立即取出瘤胃，用无菌手术刀在瘤胃背部切开口，用已灭菌的50 mL离心管盛取瘤胃内容物，用盖子密封后投入液氮中冻存待测。

1.5.3测定方法 干物质、粗蛋白质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、钙、总磷的测定均参照张丽英[14]的方法。采用苯酚-次氯酸钠比色法[15-16]测定氨态氮含量；采用PHS-3D型pH计测定pH；参照Bradford[17]提出的考马斯亮蓝法测定菌体蛋白浓度。采用气相色谱法测定挥发性脂肪酸浓度[18]。

表1 全混合饲粮组成Table 1 Composition and nutrient levels of total mixed rations

1预混料为每kg饲粮提供碳酸氢钠30.0 g，铁60.0 mg，铜22.8 mg，锌50.0 mg，锰80.0 mg，碘15.3 mg，钴12.4 mg。Premix provided the following per kg of the diet: NaHCO330.0 g, Fe (as ferrous sulfate) 60.0 mg, Cu (as copper sulfate) 22.8 mg, Zn (as zinc sulfate) 50.0 mg, Mn (as manganese sulfate) 80.0 mg, I (as potassium iodide) 15.3 mg, Co (as Cobalt chloride) 12.4 mg.2营养水平除消化能外均为实测值。Nutrient levels were measured values, except for digestive energy.

1.5.4微生物群落多样性测序与功能分析 MetaVxTM文库构建和Illumina MiSeq测序：使用Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA) 检测DNA样品的浓度，使用MetaVxTM文库构建试剂盒(GENEWIZ, Inc., South Plainfield, NJ, USA)构建测序文库。以30～50 ng DNA为模板，使用金唯智设计的一系列PCR引物扩增原核生物16S rDNA上包括V3，V4以及V5的3个高度可变区(如果有真核生物DNA污染，只扩增V3和V4区)。采用包含“CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT”序列的上游引物和包含“GGACTACNVGGGTWTCTAATCC”序列的下游引物扩增V3和V4区，采用包含“GTGYCAGCMGCCGCGGTAA”序列的上游引物和包含“CTTGTGCGGKCCCCCGYCAATTC”序列的下游引物扩增V4和V5区。另外，通过PCR向16S rDNA的PCR产物末端加上带有Index的接头，以便进行NGS测序[19]。使用Agilent 2100生物分析仪(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)检测文库质量，并且通过Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA)检测文库浓度。DNA文库混合后，按Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA)仪器使用说明书进行2×300/250 bp双端测序(paired-end, PE)，由MiSeq自带的MiSeq Control Software (MCS)读取序列信息。

数据分析：双端测序得到的正反向reads首先进行两两组装连接，过滤拼接结果中含有N的序列，保留序列长度大于200 bp的序列。经过质量过滤，去除嵌合体序列，最终得到的序列用于操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs)分析，使用VSEARCH(1.9.6)进行序列聚类(序列相似性设为97%)。然后用RDP classifier (ribosomal database program)贝叶斯算法对OTU的代表性序列进行物种分类学分析，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成[20]。基于OTU的分析结果，采用对样本序列进行随机抽样的方法，分别计算Shannon、Chao1等Alpha多样性指数，并作出稀释曲线。通过unweighted unifrac距离矩阵分析比较样本间是否有显著的微生物群落差异。

1.6 数据处理

试验数据经Excel 2007处理后，数值用“平均值±标准差”表示，并用SPSS 18.0进行t检验。

2 结果与分析

2.1 青贮饲用油菜对宜昌白山羊生产性能的影响

试验组与对照组间山羊平均日增重、干物质采食量及料重比无显著差异(P>0.05)。饲喂青贮全株玉米和青贮饲用油菜对宜昌白山羊的生产性能影响差异不显著(表2)。

2.2 青贮饲用油菜对宜昌白山羊瘤胃发酵参数和挥发性脂肪酸的影响

试验组与对照组间山羊瘤胃液pH值、氨态氮无显著差异(P>0.05)；试验组山羊瘤胃液中菌体蛋白高于对照组(P<0.05) (表3)。试验组山羊瘤胃液中异丁酸含量显著高于对照组(P<0.05)，其他挥发性脂肪酸含量差异不显著(P>0.05)。

2.3 青贮饲用油菜对白山羊瘤胃微生物多样性的影响

2.3.1样品序列测序深度和多样性分析 基于相似度大于97%的原则，将获得的有效序列进行聚类，共获得1002个OTUs(图1)。其中试验组有973个OTUs，对照组有988个，两组间共享的OTUs有959个。说明两个试验组菌群构成同时具有特异性和相似性。经计算，试验组和对照组的序列覆盖度(coverage)分别为89.36%和91.84%(表4)。

图2 中样品稀释曲线中每条曲线代表一个样本，用不同颜色标记；随测序深度增加，OTUs的数量随之增加。当曲线趋于平缓时表示随着抽取的数据量的加大，检测到的OTUs数目不再增加，此时的测序数据量较为合理。本试验的测序深度下，检测到的OTUs数目不再增加，可以覆盖样品中的大多数微生物。

表2 宜昌白山羊生产性能Table 2 Production performance of Yichang white goat

表3 瘤胃发酵参数测定值Table 3 The value of rumen fermentation parameters

注：同行不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，无字母表示差异不显著(P>0.05)。下同。

Note: In the same row, values with different small letter mean significant difference (P<0.05), and no letters indicate that the difference is not significant(P>0.05). The same below.

Alpha多样性指数主要用于评价样品中微生物的丰富性和均匀性。由表5可以看出，在同一测序深度下，比较两组的Alpha多样性指数可知，ACE、Chao1、Shannon、Simpson等指数间差异均不显著(P>0.05)。

2.3.2不同水平瘤胃微生物种群结构分析 各样本进行Illumina Miseq双末端测序，所得有效序列在不同分类水平上进行物种注释和统计，宜昌白山羊瘤胃细菌菌群结构包括19门、30纲、53科、113属。试验组和对照组样本中的细菌多样性差异不显著。

从门水平瘤胃液细菌区系物种组成的相对丰度分析(表6)，相对丰度大于0.1%的菌门，试验组有15个，对照组有14个，组间的差异不显著(P>0.05)。两组中共有的丰度较高的菌门依次是拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetae)和Saccharibacteria。其他菌门如黏胶球形菌门(Lentisphaerae)、装甲菌门(Armatimonadetes)等虽也有检出，但每个菌门的相对丰度均不足0.01%。

图1 OTUs韦恩图Fig.1 Venn graph of OTUs

图2 样品稀释曲线Fig.2 Sample dilution curve

组别 Groups有效序列数目 Nochimera有效序列平均长度Effective sequence average length (bp)有效数据的GC百分比含量GC percentage of valid data (%)有效序列数目与原始PE reads数目的百分比Ratio of nochimeras to original PE reads (%)对照组Control group221886.80±37162.40451.05±0.9053.85±0.2091.84±1.75试验组Test group162632.00±25913.45451.57±0.7554.13±0.2889.36±3.81

表5 Alpha多样性指数分析Table 5 Comparison of Alpha diversity indices of rumen microbial communities calculated

表6 瘤胃液中门水平微生物丰度Table 6 Phylum level significance analysis of rumen fluid microbes (%)

从属水平瘤胃液细菌区系物种的相对丰度分析(表7)，相对丰度在0.01%以上的属有85个。在属的水平上，两个处理组山羊瘤胃液中普雷沃氏菌属(Prevotella)微生物含量均最多。属水平上，普雷沃氏菌属-1(Prevotella_1)、理研菌属肠道组RC9(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、产乙酸糖发酵菌属(Saccharofermentans)、克里斯滕森菌科R-7(Christensenellaceae_R-7_group)、普雷沃氏菌属UCG-003(Prevotellaceae_UCG-003)、普雷沃氏菌属UCG-001(Prevotellaceae_UCG-001)和瘤胃球菌属UCG-011(Ruminococcus_UCG-011)等均为宜昌白山羊瘤胃优势菌群。试验组和对照组数量有显著差异的菌群为普雷沃氏菌属-1(Prevotella_1)(P<0.05)。不能归类到目前已知菌属的细菌相对丰度高达26.71%和22.91%。与对照组相比，青贮饲用油菜和青贮全株玉米对宜昌白山羊瘤胃中菌群的种类和丰度影响差异不显著。

3 讨论

3.1 青贮饲用油菜对宜昌白山羊瘤胃参数和挥发性脂肪酸的影响

日粮在瘤胃中发酵、有机酸的代谢情况可以用瘤胃液pH值反映。日粮对瘤胃液pH值影响较大，一般认为瘤胃液pH值的正常范围为5.5～7.5[21]。本研究中各试验组瘤胃液pH在6.7～6.8， 且组间差异不显著，说明青贮饲用油菜和青贮全株玉米在瘤胃中的发酵、代谢均正常。

表7 瘤胃液中属水平菌群分布Table 7 Level of bacterial flora abundance in rumen fluid (%)

山羊瘤胃中的氨态氮主要来源于食糜中的蛋白氮和非蛋白氮的降解，其浓度在一定程度上反映了日粮成分中的蛋白降解与合成间所达到的平衡状况。Hume[22]的体内试验表明瘤胃中氨态氮最适浓度为9 mg·dL-1。也有研究表明微生物生长对氨氮浓度耐受的临界范围为6～30 mg·dL-1[23]。本试验的两个处理组的瘤胃氨态氮浓度均适宜瘤胃微生物生长。

微生物经复杂发酵合成的瘤胃微生物蛋白质，为反刍动物小肠提供大量的可吸收蛋白质，为畜体提供所需要蛋白质的40%～60%，是最主要的氮源供应者[24]。瘤胃内碳水化合物和氮的利用效率决定了微生物蛋白质的合成情况。本研究中试验组宜昌白山羊瘤胃液菌体蛋白高于对照组，说明青贮饲用油菜的营养物质更有利于瘤胃微生物蛋白质的合成。

反刍动物主要的能量来源之一是挥发性脂肪酸，日粮组成影响瘤胃发酵合成挥发性脂肪酸的效率和浓度等。梁艾东[25]报道，全株青贮玉米对肉羊瘤胃pH、NH3-N浓度以及乙酸、丙酸、丁酸浓度均有不同程度的影响。但是张显东[26]报道，全株玉米青贮对绵羊瘤胃液pH值变化有较大影响，对绵羊瘤胃的NH3-N浓度、挥发性脂肪酸浓度和瘤胃液稀释率影响较小。曲永利等[27]发现饲喂不同收获期玉米青贮日粮对奶牛瘤胃内环境及发酵产物的影响不显著。本研究中两个处理组日粮经瘤胃微生物发酵后的主要产物为乙酸，瘤胃发酵类型主要是乙酸型。异丁酸是异位酸之一，本研究中试验组异丁酸含量显著高于对照组，但是两组间其他挥发性脂肪酸的含量均无显著差异；试验组山羊瘤胃中菌体蛋白含量也高于对照组，造成这一现象的原因可能是由于异丁酸可以缓解瘤胃蛋白质降解速度，提高菌体蛋白质浓度[28]。

3.2 青贮饲用油菜对白山羊瘤胃微生物多样性的影响

瘤胃微生物多样性受多方面的影响，其中日粮组成对瘤胃微生物有显著的影响。反过来，瘤胃微生物也影响到宿主的营养、代谢和免疫等[29]。高通量测序技术对不同日粮处理的反刍动物瘤胃内容物样品检测后，采用可获得大量微生物的生物学信息，便于更准确地分析日粮与瘤胃微生物的关系[30]，在研究日粮组成对反刍动物瘤胃微生物影响的相关方面效果明显优于传统方法。

本研究经Illumina Miseq双末端测序得知，试验组和对照组宜昌白山羊瘤胃细菌多样性差异不显著。两组中共享的丰度较高的菌门依次是拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetae)和Saccharibacteria。这与以往的研究结果相一致[31-32]，拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)在很多草食动物胃肠道微生物中均为优势菌门。瘤胃中非纤维性碳水化合物的主要降解者为拟杆菌门微生物，如普雷沃氏菌属；而厚壁菌门含有大量分解纤维的菌属，如瘤胃球菌属、丁酸弧菌属、假丁酸弧菌属等。

在属的水平上，本试验两个组的山羊瘤胃液中普雷沃氏菌属(Prevotella)的丰度均最高，提示了此菌属在瘤胃发酵中的重要性。宜昌白山羊瘤胃核心微生物组大部分为普氏菌。反刍动物瘤胃内的普雷沃菌属对多种营养物质的降解都有着极其重要的作用[33]。Avgustin等[34]研究表明普雷沃菌属虽然不能降解纤维素，但却是瘤胃中主要的蛋白降解菌之一；普雷沃氏菌属属于耗氢菌，主要分解蛋白质、淀粉。本研究结果，对照组山羊瘤胃中Prevotella_1数量高于试验组，瘤胃液中菌体蛋白含量结果与之相反，可能是普雷沃菌属中Prevotella_1降解了瘤胃中的菌体蛋白。

本研究发现，普雷沃氏菌属、理研菌属肠道组RC9(Rikenellaceae_RC9_gut_group)、产乙酸糖发酵菌属(Saccharofermentanst)、克里斯滕森菌科R-7群(Christensenellaceae_R-7_group)、瘤胃球菌属UCG-011(Ruminococcus_UCG-011)等为宜昌白山羊瘤胃优势菌群。瘤胃球菌属(Ruminococcus)曾被认为是瘤胃中主要的纤维降解菌，该属所含的白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌能分泌大量的纤维素酶和半纤维素酶[35-36]，其丰度的提高能显著促进瘤胃内营养物质的消化利用。但已有大量研究表明，瘤胃球菌属的相对丰度在瘤胃微生物中仅占很小的比例[37-38]，而本研究中试验组和对照组山羊瘤胃中瘤胃球菌属相对丰度分别达到4.5%和3.5%左右。瘤胃中的纤维降解菌除瘤胃球菌外，还有产琥珀酸丝状杆菌、溶纤维丁酸弧菌和梭菌等，但是本次检测结果这几种菌的丰度均不高。

Alpha多样性指数中的Chao1指数、ACE指数反映样品中物种群落的丰富度，Shannon指数、Simpson指数则反映物种的多样性。本研究中在同一测序深度下，两组的Chao1、Shannon、Simpson等指数间差异均不显著，说明青贮饲用油菜和青贮全株玉米对瘤胃微生物的丰富度和多样性影响无显著差异。

日粮的营养成分显著影响瘤胃微生物数量、挥发性脂肪酸含量等[39]，本研究中青贮饲用油菜与青贮全株玉米相比，对宜昌白山羊瘤胃发酵参数、瘤胃菌群结构无不良影响。与青贮玉米相比，饲用油菜的适宜种植地域广阔，生物产量更高，在草食动物的养殖上具有较好的应用前景。

4 结论

结合瘤胃发酵参数和微生物菌群高通量测序结果，饲喂青贮饲用油菜能保持山羊瘤胃内环境及微生物菌群结构稳定，维持瘤胃正常发酵。