豌豆与根瘤共生对水分胁迫的生理响应

马蕾，马绍英，陈贵平，柴强*，李胜

(1.甘肃农业大学农学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃 兰州730070；3.甘肃农业大学基础教学实验中心，甘肃 兰州730070；4.甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃 兰州730070)

豌豆(Pisumsativum)作为一种粮、菜、饲、肥兼用作物[1]，因其有广泛的用途、丰富的营养和较高的经济价值，受到生产者和消费者的喜爱。近年来由于干旱问题的日趋严重，导致水分匮缺成为限制豌豆产量、质量和种植效益的主要逆境因子[2]。因此，在水资源严重匮乏的环境压力下，研究豌豆的抗旱性具有重要的应用价值。

根瘤菌(Rhizobium)可与豆科植物共生，形成根瘤并固定空气中的氮气供植物营养的一类杆状细菌。这种共生体系具有较强的固氮能力，同时根瘤菌自身的抗旱性可以改善干旱地区的植被状况及提高其农业生产能力。据报道，部分在豆科植物上结瘤的根瘤菌，如大豆(Glycinemax)根瘤菌、豌豆根瘤菌等对高渗透环境均较敏感，而在逆境条件下分布的根瘤菌菌株却表现出与环境良好的适应性[3]。因此，探索豆科植物与根瘤菌共生对逆境的适应性有很大的意义。

研究表明，植物的抗旱性主要表现在渗透调节物质的积累、膜脂成分的变化、自由基的清除作用、蛋白的诱导形成和激素调节等综合因素作用的结果[4]。水分胁迫会引起超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、过氧化物酶(peroxidase, POD)、脯氨酸(proline, Pro)、可溶性糖和丙二醛(malondialdehyde, MDA)等生理生化指标的变化。郑世英等[5]研究得出，小麦(Triticumaestivum)在水分胁迫下SOD活性先升高后降低。顾建勤等[6]认为，豌豆在干旱胁迫下POD和CAT活性明显升高，且随胁迫程度的加重和时间的延长增幅加大。张永杰等[7]和赵振宁等[8]研究表明，小麦和大豆在干旱胁迫下渗透调节物质Pro和可溶性糖含量明显增加。季杨等[9]研究发现，鸭茅(Dactylisglomerate)由于干旱胁迫造成植物体内大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)的积累，导致膜脂过氧化水平增高，MDA含量增加，使细胞膜结构被破坏，从而损害植物的生长。张攀等[10]得出，苜蓿(Medicagosativa)与根瘤共生后，在逆境胁迫条件下，SOD、POD、CAT、Pro、可溶性糖含量显著高于不接菌处理，而MDA含量低于不接菌处理。李莎莎等[11]认为，根瘤菌共生紫花苜蓿在逆境下具有更强的膜稳定性、活性氧干旱防御以及渗透调节能力，对环境适应性更强。目前根瘤菌共生在提高苜蓿抗逆性的研究中报道较多，但对豌豆根瘤菌共生提高抗逆性的报道尚少，为了更好地了解根瘤菌在共生条件下对豌豆抗旱性的效应，本试验研究了不接种根瘤菌和根瘤共生的豌豆在水分胁迫下地上部和地下部SOD、POD、CAT、Pro、MDA、可溶性糖等活性及含量变化，以期初步阐明豌豆植株与根瘤菌共生对水分胁迫的生理响应机制，为豌豆的抗旱栽培提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

以定西市农业科学院提供的抗旱品种定豌8号和甘肃省农业科学院提供的非抗旱品种陇豌6号为供试植物材料；以甘肃农业大学草业学院提供的苜蓿根瘤菌Da99菌株和中国微生物菌种保藏中心提供的豌豆根瘤菌15735菌株为供试菌株。

1.2 试验方法

试验于2018年4月2日播种，播种前用无菌水浸泡两种豌豆种子5 h，并在光照培养箱中培养至发芽。对发芽的豌豆种子筛选后进行菌液的浸泡接种，同时以无菌水浸泡的豌豆种子作对照。播种于高35 cm，内径30 cm的试验用盆中，供试土壤取自黄土高原半干旱区的定西市安定区凤翔镇景家店村，上茬种植作物为小麦，土壤为黄绵土，过筛(0.85 mm)后自然风干，每盆装9.5 kg。试验每个处理3次重复，每盆盆栽等距离播种25粒种子，深度3～5 cm，适量浇水，使土壤含水量达到田间持水量的75%，保持至出苗。待苗高达6～7 cm时开始水分胁迫处理。

水分胁迫时期为从苗期至结荚期，胁迫程度分轻度胁迫(田间持水量的55%)和重度胁迫(田间持水量的35%)，并以充分供水(田间持水量的75%)为对照。水分控制用称重法，每两天称重一次。每次称重后的试验盆随机摆放，减小边际效应。

水分胁迫处理20 d后，取一次鲜样，为苗期测定材料。根据测定项目，取样时从每个处理中随机选取6株植株用于各指标的测定。将豌豆植株取出，根部用水冲洗干净，在根茎分界点剪开，分离地上与地下部分并用液氮速冻后于-80 ℃低温冰箱中保存待测。花期和结荚期以同样的方法各采样一次。

1.3 测定项目与方法

1.3.1生理指标 采用磺基水杨法测定脯氨酸(Pro)含量[12]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定[12]；采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量[12]；采用氮蓝四唑还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性[12]；采用钼酸铵比色法测定过氧化氢酶(CAT)活性[12]；采用愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性[12]。

1.3.2抗旱性评价方法 应用模糊数学中的隶属函数值法，以6个生理指标进行综合评价，隶属函数值计算公式：

R(X)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

R(X)=1-(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

式中：X为指标测定值，Xmin、Xmax分别为2个豌豆品种所测某一指标的最小值和最大值。如果该指标与抗旱性呈正相关，则采用(1)式计算隶属值，如果相反，则用(2)式计算。将抗旱隶属函数值进行累加，并求得平均值，平均值越大，抗旱性越强[13]。

1.4 数据处理

采用Excel 2010和SPSS 22.0软件进行数据的统计分析。

2 结果与分析

2.1 SOD活性的变化

作物遇到干旱脱水时，产生大量的O2-，对植物细胞产生伤害。SOD是植物体内消除伤害O2-的保护性酶[14-15]。在胁迫条件下，根瘤共生豌豆植株中SOD活性高于不接种根瘤菌的豌豆，其中在轻度水分胁迫下根瘤共生豌豆中SOD活性显著高于不接菌处理(P<0.05)(表1和表2)。

各生育期不接菌处理的豌豆植株中SOD活性随着水分胁迫程度地增加而降低，根瘤共生的豌豆植株中SOD活性则随着水分胁迫程度地增加呈现先上升后下降的趋势。同时，不同菌对豌豆SOD活性的影响程度不同，在胁迫条件下，接种15735菌的两个豌豆植株中SOD活性均高于接种Da99菌处理。其中在重度胁迫下，各生育期的地上部分接种15735菌的定豌8号的SOD活性较不接菌处理分别增加了29.96%、49.52%、94.57%，接种Da99菌的SOD活性较不接菌分别增加了7.76%、4.97%、18.65%，相同条件下，接种15735菌的陇豌6号的SOD活性较不接菌分别增加了20.19%、46.56%、81.31%，接种Da99菌的SOD活性较不接菌分别增加了14.13%、42.11%、3.55%。

2.2 CAT活性的变化

植物在干旱胁迫下，体内H2O2发生累积使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体，而CAT可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一[16]。胁迫条件下，根瘤共生豌豆植株中CAT活性显著高于不接种处理(P<0.05)，随着水分胁迫程度地增加不接种根瘤菌的定豌8号植株中CAT活性呈现先升高后降低的趋势，而相同处理的陇豌6号则随水分胁迫程度地增加而降低(表3和表4)。根瘤共生的两种豌豆植株中CAT活性均随着水分胁迫程度地增加而增加，地上部和地下部变化规律相似。同时，不同菌对豌豆CAT活性的影响程度也有差异，在重度胁迫条件下，接种15735菌的豌豆植株中CAT活性高于接种Da99菌处理。

表1 水分胁迫下定豌8号地上、地下部分SOD活性的变化Table 1 Changes of SOD activity in the aboveground and underground parts of Ding wan 8 under water stress (U·g-1 FW)

注：以同一时期的无菌和接菌处理为一组进行显著性分析，同一时期所有处理的不同小写字母表示在0.05水平差异显著。下同。

Note: The significance of aseptic and bacteria-treated in the same period was analyzed in a group, the different lowercase letters of all treatments at the same period indicate significant differences at 0.05 level. The same below.

表3 水分胁迫下定豌8号地上、地下部分CAT活性的变化Table 3 Changes of CAT activity in the aboveground and underground parts of Ding wan 8 under water stress (U·g-1 FW·min-1)

2.3 POD活性的变化

植物受到干旱胁迫时，细胞内会积累大量的ROS。在ROS代谢过程中，POD发挥着重要作用。POD可催化H2O2分解为H2O和O2，是细胞内重要的清除剂[17-18]。水分胁迫下，根瘤共生的豌豆植株POD活性随着水分胁迫程度地增加而增加，除陇豌6号地上部苗期，不接菌的豌豆植株随胁迫程度地增加呈现先升高后降低的趋势(表5和表6)。在重度胁迫下，根瘤共生的豌豆植株中POD活性显著高于不接菌处理(P<0.05)。接种不同菌对植株的POD活性影响存在差异，接种15735菌的豌豆植株中POD活性高于接种Da99菌处理，且在重度胁迫下差异显著(P<0.05)。同时接种同种菌对不同豌豆POD活性的影响不同，其中在重度胁迫下，地上部的各生育期接种15735菌的定豌8号中POD活性较不接菌处理分别增加了72.58%、48.25%、28.79%，陇豌6号较不接菌处理分别增加了58.51%、23.51%、39.13%，接种Da99菌的定豌8号较不接菌处理分别增加了20.84%，23.38%、14.69%，陇豌6号较不接菌分别增加了31.98%、15.20%、19.34%。

表5 水分胁迫下定豌8号地上、地下部分POD活性的变化Table 5 Changes of POD activity in the aboveground and underground parts of Ding wan 8 under water stress (U·min-1·g-1 FW)

2.4 脯氨酸含量的变化

Pro是植物对逆境反应敏感的一种重要的渗透调节物质，一般情况下，Pro随着干旱胁迫程度地增加而大量积累，Pro的含量与植物的抗旱性成正比，是反应植株抗旱性强弱的重要指标[19]。根瘤共生豌豆植株和不接菌的定豌8号植株Pro的含量均随水分胁迫程度和时间的延长而增加，而陇豌6号在不接菌的处理下呈现先增加后降低的趋势(表7和表8)。接种根瘤菌处理的豌豆中Pro含量均高于不接菌处理的豌豆，且在重度胁迫下差异显著(P<0.05)。同时除定豌8号地下部苗期和花期的轻度胁迫外，其余胁迫条件下，接种15735菌的豌豆植株中Pro含量均高于接种Da99菌的处理。其中在重度胁迫下，地上部接种15735菌的定豌8号从苗期至结荚期Pro含量的变化分别较不接菌的处理和接种Da99菌处理的定豌8号高212.17%、38.01%，接种15735菌的陇豌6号从苗期至结荚期Pro含量的变化较不接菌处理的陇豌6号高111.82%。表明定豌8号能积累更多的Pro以适应干旱胁迫，同时接种根瘤菌Da99和15735均能提高豌豆的Pro含量，但两种菌种间存在显著差异(P<0.05)。

表6 水分胁迫下陇豌6号地上、地下部分POD活性的变化Table 6 Changes of POD activity in the aboveground and underground parts of Long wan 6 under water stress (U·min-1·g-1 FW)

表7 水分胁迫下定豌8号地上、地下部分脯氨酸含量的变化Table 7 Changes of proline content in the aboveground and underground parts of Ding wan 8 under water stress (μg·g-1 FW)

表8 水分胁迫下陇豌6号地上、地下部分脯氨酸含量的变化Table 8 Changes of proline content in the aboveground and underground parts of Long wan 6 under water stress (μg·g-1 FW)

2.5 可溶性糖含量的变化

可溶性糖是植物应对水分胁迫的主要渗透调节物质，维持渗透平衡，使植物抵御干旱引起的伤害，维持植株的正常代谢[20]。如表9和表10所示，可溶性糖含量因豌豆品种的不同而呈现不同的变化趋势。其中定豌8号地上部和地下部可溶性糖含量均随水分胁迫程度地增加而增加，接种15735菌的定豌8号在水分胁迫下可溶性糖含量显著高于不接种根瘤菌的处理(P<0.05)。在轻度和重度胁迫下，接种15735菌的定豌8号中可溶性糖含量显著高于接种Da99菌处理(P<0.05)。其中在地上部的结荚期，接种15735菌的定豌8号中可溶性糖含量最高，是相同条件下接种Da99菌处理的1.24倍。除苗期不接菌处理，陇豌6号的地上部和地下部在不接菌和接种Da99菌的处理下可溶性糖的含量均随水分胁迫程度地增加而呈现先上升后下降的趋势，而在接种15735菌的处理下可溶性糖的含量随水分胁迫程度地增加而增加。其中在重度胁迫下，接种15735菌的陇豌6号中可溶性糖含量显著高于接种Da99菌处理(P<0.05)。

2.6 MDA含量的变化

MDA含量的高低是反应细胞膜脂过氧化作用强弱和质膜破坏程度的重要指标[19]。豌豆植株中MDA含量随水分胁迫程度地增加而增加。接种根瘤菌的豌豆中MDA含量低于不接菌处理，其中在胁迫条件下接种15735菌的豌豆植株中MDA含量低于接种Da99菌处理(表11和表12)。同时在轻度和重度胁迫条件下，两个品种均是地上部MDA含量高于地下部，不同菌株对两个豌豆品种在受到水分胁迫后MDA含量变化的影响也存在差异，在重度胁迫下，接种15735菌的定豌8号地上部从苗期至结荚期MDA含量较不接菌处理分别降低了10.04%、35.64%、29.83%，接种Da99菌的MDA含量较不接菌分别降低了2.62%、25.25%、18.56%，同时陇豌6号接种15735菌的MDA含量较不接菌分别降低了9.20%、13.35%、13.33%，接种Da99菌的MDA含量较不接菌分别降低了0.55%、7.33%、8.96%。说明根瘤共生可降低豌豆植株在水分胁迫下MDA的含量以减少对细胞膜的损伤。同时接种15735菌较Da99菌更能降低细胞膜脂质过氧化作用对细胞膜的损害，且与定豌8号更匹配。

表9 水分胁迫下定豌8号地上、地下部分可溶性糖含量的变化 Table 9 Changes of soluble sugar content in the aboveground and underground parts of Ding wan 8 under water stress (mg·g-1)

表10 水分胁迫下陇豌6号地上、地下部分可溶性糖含量的变化Table 10 Changes of soluble sugar content in the aboveground and underground parts of Long wan 6 under water stress (mg·g-1)

表11 水分胁迫下定豌8号地上、地下部分MDA含量的变化Table 11 Changes of MDA content in the aboveground and underground parts of Ding wan 8 under water stress (μmol·g-1)

表12 水分胁迫下陇豌6号地上、地下部分MDA含量的变化Table 12 Changes of MDA content in the aboveground and underground parts of Long wan 6 under water stress (μmol·g-1)

2.7 水分胁迫下不同菌种对两种豌豆品种综合生理指标效应的隶属函数分析

以SOD、CAT、POD、Pro、可溶性糖、MDA 6个抗旱性相关指标为依据，计算各个指标的平均隶属函数值，并进行抗旱能力综合评价。在充分供水和胁迫条件下，接种15735菌的定豌8号隶属平均值均最高，其次为接种15735菌的陇豌6号(表13～15)。在充分供水和轻度胁迫条件下接种Da99菌的陇豌6号隶属平均值高于定豌8号，但在重度胁迫下，定豌8号的隶属平均值高于陇豌6号。隶属平均值越大抗旱性越强，说明接种15735菌较Da99菌更能提高豌豆的抗旱性，同时与定豌8号的匹配性更好。

表13 充分供水条件下不同菌种对两个豌豆品种综合生理指标的平均隶属函数值Table 13 Average subordinate function values of different strains for two pea varieties under adequate water supply condition

表14 轻度胁迫条件下不同菌种对两种豌豆品种综合生理指标的平均隶属函数值Table 14 Average subordinate function values of different strains for two pea varieties under mild water stress condition

表15 重度胁迫条件下不同菌种对两种豌豆品种综合生理指标的平均隶属函数值Table 15 Average subordinate function values of different strains for two pea varieties under severe water stress condition

3 讨论

ROS是对植物有害的一类氧自由基，是植物在正常条件下细胞氧化产生的副产物[21-22]，当植物受到干旱胁迫时体内ROS急剧增多，高浓度的ROS会对细胞膜系统造成伤害[23]。植物防御系统中存在一个专门清除和修复ROS的系统，包括多种清除ROS中间体的酶类，如SOD、CAT、POD等，SOD能催化清除超氧自由基，并将其转化为H2O2，CAT和POD则催化清除植物体内多余的H2O2，保护膜系统免受ROS伤害[11]。渗透调节是植物抗旱的一种重要生理机制，与植物抗旱性密切相关[24-25]。当植物受到水分胁迫时，通过Pro、可溶性糖等渗透调节物质的积累来提高渗透压，维持植物正常的生长代谢[10]。MDA是植物细胞膜过氧化的产物，其含量的高低经常作为判断膜脂过氧化伤害程度的重要指标[26]。接种根瘤后豆科植物提供根瘤菌所需养分，同时根瘤菌可以固定大气中的氮素供给豆科植物。根瘤菌在生长发育中向土壤中释放一定的有机态氮，加之，根瘤在植物衰老死亡后脱落解体，释放有机质，从而大大提高了土壤的肥力，改善植株生长状况，提高植株的抗旱性。本研究发现豌豆接种根瘤菌后，在水分胁迫的环境下，根瘤菌通过与豌豆植株的共生系统来调控植株的生长和生理应答机制来降低水分胁迫的危害。在水分胁迫下，接种根瘤菌的豌豆植株中SOD，CAT，POD与不接菌相比均有增加，但3种酶的变化趋势有所差异。其中接种根瘤菌的豌豆植株中SOD活性从轻度到重度出现下降，可能是由于SOD作为一种诱导酶，在轻度水分胁迫下，植物体产生较多的超氧阴离子，诱导SOD基因表达，所以SOD活性增加，而在重度水分胁迫下，植物体内代谢紊乱，SOD基因表达受阻，SOD活性下降[23]。根瘤共生的豌豆在受到水分胁迫时体内的Pro和可溶性糖含量均高于不接菌处理，而MDA含量与不接菌相比均有所下降，这与张攀等[10]在紫花苜蓿上的研究结果一致。说明接种根瘤菌可以提高豌豆抵御ROS伤害、增强渗透调节能力，减少膜脂过氧化作用对细胞膜的损害，从而提高豌豆的抗旱性，而且不同菌株对不同豌豆的生理调节能力不同，这可能与豌豆品种、根瘤菌自身以及根瘤菌与豌豆植株形成的共生体系的抗旱性发生变化有关。

植物的抗旱性是一个复杂的性状，受到多种生理因素的影响，单一的指标变化很难确定和比较植株整体的抗旱性。运用模糊数学中的隶属函数法对各个指标进行综合分析后发现，在充分供水以及不同的水分胁迫条件下，接种根瘤菌对植株的生理变化均产生一定的影响，且不同根瘤菌对同一品种的豌豆接种效果不同，同一根瘤菌对不同品种的豌豆接种效果也不同，说明接种根瘤菌对豌豆的抗旱性影响较大。尤其是接种15735菌的两种豌豆，随着水分胁迫程度的增加，隶属平均值均增加，且在定豌8号的重度胁迫下达到最大，其抗旱性最强，这可能与根瘤菌自身的抗旱基因以及在豌豆共生过程中该基因的表达有关，而根瘤菌与豆科植物共生的具体作用机制还有待进一步深入研究。

4 结论

豌豆与根瘤共生对水分胁迫的响应可以通过细胞内多种生理指标的变化来表征。接种根瘤菌能显著提高豌豆抗旱性，且存在明显的菌种和豌豆基因之间的差异。本研究采用模糊数学中的隶属函数法，综合6个指标对水分胁迫下接种根瘤菌对豌豆抗旱性影响进行分析，发现接种15735菌处理的豌豆抗旱性显著优于接种Da99菌处理，其中接种15735菌的定豌8号抗旱性更强，说明根瘤菌与豌豆越匹配其抗性也越强。