雌激素对脑缺血再灌注损伤自由基代谢及神经保护作用研究

刘娅迪， 陆瑞婷， 王迪芬

贵州省医科大学附属医院 ICU，贵州 贵阳 550001

脑卒中患者预后较差，常伴有认知功能障碍、偏瘫等神经系统后遗症[1-2]。脑缺血再灌注产生的氧自由基及炎性因子是导致神经元损伤及影响愈后的重要因素[3]。有研究表明，海马神经元损伤及细胞凋亡与氧化应激、炎症反应密切相关，雌激素具有一定的神经保护作用[4]。而雌激素是否通过改善氧自由基代谢、调控炎性因子水平发挥神经保护作用，具体机制尚不清楚。本研究参照文献[5-6]方法，采用改良Longa线栓阻塞法建立右侧大脑中动脉闭塞局灶性脑缺血再灌注模型，生化法测定脑组织丙二醛(malondialdehyde，MDA)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、过氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)含量，免疫印迹法检测肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、单核细胞趋化因子(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)及脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)蛋白表达，探讨雌激素对脑组织的作用及机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 选取雄性SD大鼠30只(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司)，鼠龄3～4个月，体质量200～250 g，动物自由觅食、饮水，适应性喂养1周。采用随机数字表法分为假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)和雌激素组(E组)，每组 10 只。雌激素购自天津金耀氨基酸有限公司；SOD、MDA及CAT生化试剂盒购自南京建成生物有限公司；磷酸甘油醛脱氢酶(reduced glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、TNF-α、MCP-1和BDNF等兔抗大鼠一抗购自美国 Abcom公司；二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid disodium,BCA)试剂盒购自武汉碧云天有限公司；苏木素-伊红染色(hematoxylineosin staining，HE)试剂盒购自天津百浩生物科技有限公司；线栓3600AAA购自广州佳灵生物技术有限公司。

1.2 研究方法 造模前，E组腹腔注射雌激素10 μg/kg，E组和I/R 组给予等量生理盐水，连续给药7 d，于末次给药1 h后开始造模，S组仅分离动脉血管，不结扎，不插线栓。E组和I/R 组采用改良Longa线栓阻塞法建立右侧大脑中动脉闭塞局灶性脑缺学再灌注模型：(1)10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，颈部备皮、消毒、切开皮肤，分离右侧颈总、颈内和颈外动脉。(2)于颈内、外动脉分叉处结扎颈外动脉，近心端结扎颈总动脉。(3)动脉夹夹闭颈内动脉，在颈总动脉结扎处远端约3 mm处剪一小口，将线栓沿颈总动脉向颈内动脉方向推入，至动脉夹夹闭处时松开动脉夹，经颈内动脉缓慢推入至大脑前动脉近端，约插入 18～22 mm。固定线栓，缝合伤口。120 min后回抽线栓至颈总动脉分叉处。实验造模过程中及动物苏醒期间注意保暖，避免大鼠死亡。

造模后24 h，用过量水合氯醛深度麻醉处死大鼠，断头冰下解剖大脑取脑组织。每组取4只大鼠脑组织经4%多聚甲醛固定后，行石蜡包埋常规切片。HE染色后，观察脑组织海马区病理学改变，比较各组大鼠脑组织海马神经元损伤情况。取适量脑组织以1∶9的比例采用生理盐水进行组织匀浆，4℃下离心10 min后取上清，测定各组大鼠脑组织重SOD、MDA及CAT含量。取海马组织以1∶10的比例采用1%的苯甲磺酰氟裂解液匀浆提取蛋白样品，4℃下离心10 min后取上清，BCA试剂盒测定蛋白含量并调节蛋白浓度至相同，加缓冲液沸水浴10 min，-80℃保存备用。取15 μl样品上样，通过10%SDS-P聚丙酰胺凝胶电泳跑胶分离蛋白，湿法转膜，脱脂奶粉封闭。分别加入GAPDH、TNF-α、MCP-1和BDNF(1∶2 000，武汉安特捷有限公司)抗体4℃孵育过夜，次日加入二抗室温孵育后，曝光显影获得蛋白条带。

2 结果

2.1 3组脑组织病理改变 S组脑组织未见病理改变，海马区神经细胞排列整齐、形态正常、结构完整。I/R组海马区则有明显空泡样病变，神经细胞排列混乱、形态破裂、边界模糊，有大量炎性细胞浸润。E组大鼠海马区神经细胞排列有序、形态基本正常、结构较完整，病变较I/R组有明显改善。见图1。

2.2 3组SOD、MDA及CAT含量情况 I/R组、E组大鼠脑组织SOD、CAT较S组明显降低，MDA显著增多，差异有统计学意义(P<0.05)；E组SOD、CAT高于I/R组，MDA显著减少，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

图1 3组大鼠脑组织病理结果(HE×200，a.S组；b.I/R组；c.E组)

2.3 3组大鼠脑组织TNF-α、MCP-1和BDNF蛋白表达 与S组比较，I/R组大鼠海马区TNF-α和MCP-1蛋白水平明显升高，而BDNF蛋白含量减少，差异有统计学意义(P<0.05)； 与I/R组比较，E组大鼠海马组织TNF-α和MCP-1表达下调，BDNF表达增加，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

表1 各组大鼠脑组织SOD、MDA及CAT含量变化

注：与S组比较，①P<0.05；与I/R组比较，②P<0.05

图2 3组大鼠脑组织TNF-α、MCP-1和BDNF蛋白表达

3 讨论

氧化应激、炎症反应是加剧脑缺血-再灌注损伤的重要因素，氧自由基相关物质SOD、MDA、CAT改变，炎性因子TNF-α、MCP-1的增加均会导致大脑海马组织病变和神经元损伤[6-8]。BDNF对维持神经元功能具有重要作用，在脑缺血再灌注损伤中表达异常，进而激活相关信号通路，最终诱导神经元细胞凋亡。雌激素对大鼠脑缺血再灌注有神经保护作用[9]，但其具体机制仍不清楚，本研究通过检测脑组织氧化应激相关物质SOD、MDA、CAT含量，TNF-α、MCP-1及BDNF蛋白表达，探讨雌激素对脑组织的保护作用。

I/R组病理结果证实，大鼠脑组织神经元细胞破裂，发生空泡样病变，大量炎性细胞浸润，表明脑缺血再灌注损伤造模成功。E组海马组织神经细胞排列渐进有序，结构及形态基本接近正常，说明雌激素对缺血再灌注损伤组织具有保护作用，与相关报道一致[10-11]。缺血再灌注中产生大量氧自由基，进而损伤神经细胞，MDA作为脂质过氧化作用的最终产物，可间接反映细胞损伤的程度，而SOD和CAT具有清除氧自由基的作用，反映机体的抗氧化应激能力[12-13]。本研究生化结果显示，I/R组大鼠脑组织中有害物质MDA较S组明显增多，且SOD、CAT降低；E组SOD、CAT水平较I/R组显著升高，MDA含量减少，表明雌激素可抵御自由基造成的神经细胞损伤，具有一定抗氧化应激作用。缺血缺氧刺激下，炎症反应激活，大量释放介导炎性因子参与机体免疫应答，有神经毒性作用。与S组比较，I/R组大鼠海马区TNF-α和MCP-1蛋白水平明显升高，炎性细胞浸润释放炎性介质导致神经细胞坏死凋亡。E组TNF-α和MCP-1表达下调，炎症反应得到抑制。

BDNF在脑缺血再灌注损伤中对维持海马区神经元活性及功能，抑制细胞凋亡发挥重要作用[8]。在大脑缺血、缺氧等刺激下，氧自由基大量释放，炎症反应被激活， I/R组BDNF等神经营养因子表达下调，进而介导后续信号通路及级联反应，诱导神经细胞凋亡。雌激素干预后，氧化应激及炎症反应有所缓解，脑组织BDNF应激性上调，抑制神经细胞凋亡[13]，本研究结果证实E组BDNF表达较I/R组明显增加，海马区神经元损伤及神经细胞凋亡减少。

综上所述，雌激素能改善脑缺血再灌注中氧化应激造成的损伤，通过减少MDA释放，增加SOD、CAT水平，下调TNF-α、MCP-1，上调BDNF表达发挥抗炎及保护神经元作用。