去甲肾上腺素在抑郁状态下提高乳腺癌的恶性程度

2019-09-24欧阳雪岩

中国药理学通报 2019年10期

欧阳雪岩，朱朕，杨超，王丽，丁罡,4，姜峰

(1. 上海交通大学医学院，上海 200025；2. 上海大学生命科学学院，上海 200444；3. 上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院癌痛转化研究所，上海 202150；4. 上海国际医学中心，上海 201318)

乳腺癌在女性中发病率最高，且乳腺癌患者更易罹患心理疾病[1]。抑郁症作为世界第四大常见疾病，被认为是影响乳腺癌预后的一个独立危险因素[2]。有临床研究显示，存在抑郁症状的癌症患者预后较差[3]。因此，本研究从临床现象出发，利用体内实验和体外实验，探究抑郁对乳腺癌恶性程度的影响，以期加强临床治疗过程中对肿瘤患者情绪管理的重视程度。

1 材料与方法

1.1 临床资料

1.1.1一般资料选取上海交通大学医学院附属新华医院崇明分院2018年1月～2018年12月收治的乳腺癌患者116例，女性，年龄40～65岁。所有病例均由病理学及临床诊断确诊。

1.1.2研究方法采用问卷调查法对肿瘤患者心理状况进行评价分析，并与国内常模进行比较[4]，评定时间为肿瘤患者近1周的心理状况。在患者签署知情同意书后方可进行。

1.1.3评价工具对入选的肿瘤患者采用Zung编制的抑郁自评量表(SDS)进行评测[4]，SDS量表采用1～4级评分，共20个项目，总分80分。标准分等于总评分乘以1.25。SDS标准分<53为无抑郁组，53～62分为轻度抑郁组，63～72分为中度抑郁组，>73分为重度抑郁组。

1.1.4统计学处理采用SPSS 22.0统计软件对收集数据进行统计分析。评定结果以%表示。与国内常模进行比较分析，采用独立结果t检验。

1.2 慢性轻度不可预测性应激模型(chronic unpredictable mild stress model, CUMS)

1.2.1实验动物该部分实验所有小鼠分为两组，每组包含10只♀ C57BL/6小鼠，体质量20～25 g，购自上海捷斯杰实验动物有限公司，许可证号：SCXK(沪)2018-0004，用于CUMS模型的构建。动物实验按照上海交通大学医学院动物护理与使用委员会批准的方案进行。

1.2.2造模方案造模方案参考Jaggi等[5]已发表文献，并在此基础上稍作调整。将小鼠置于明暗12 h∶12 h的循环中(早上7点开灯)，室温25 ℃，小鼠可自由地获得水和食物。将小鼠随机分为对照组或实验组(n=10)。实验组暴露于不可预见的应激源下，对照组则不经历应激。实验组应激刺激具体过程见Tab 1。在这些应激刺激之后，使用行为学检测(旷场实验、强迫游泳实验和蔗糖偏好实验)来确认动物是否具有明显的抑郁症状。

1.2.3小鼠皮下荷瘤模型参考谢贵林等[6]利用C57BL/6小鼠皮下接种乳腺癌细胞构建小鼠荷瘤模型的方法及经验，在造模成功后，对所有动物进行皮下接种乳腺癌细胞。接种乳腺癌细胞之前，首先将小鼠置于X射线下照射4 h，注射免疫抑制剂环磷酰胺35 mg·kg-1，降低其免疫功能。小鼠皮下注射悬浮在0.2 mL PBS中的MCF-7细胞(1×107)。两周后处死小鼠，剥离肿瘤，计算肿瘤体积：肿瘤体积=(a×b2)/2，其中a为最大表面直径，b为最小表面直径，并收集所有动物的血清。

Tab 1 CUMS model procedure

1.3 ELISA法检测去甲肾上腺素水平在模型建立结束时，收集来自对照组和实验组动物的血液。将收集的样品在室温下静置40 min，然后3 000 r·min-1、4 ℃离心10 min。吸出300 μL血清，加入等体积的HCl后，1 000 r·min-1、4 ℃离心10 min。使用ELISA试剂盒(江苏酶免实业有限公司)检测血清中的去甲肾上腺素。每个样品测定3次，并且基于标准曲线计算每个样品的平均OD值。该实验过程独立重复3次。

1.4 细胞培养人乳腺癌细胞系MCF-7，购自上海生命科学研究院和中国科学院细胞库。细胞在DMEM培养基中培养，添加1%双抗和10%热灭活的胎牛血清(Thermo Fisher Scientific)，在37 ℃、5% CO2的环境中培养。

1.5 免疫荧光染色将MCF-7细胞以2×104个细胞的密度加入6孔板中，盖上盖玻片24 h后，用预冷的PBS洗涤3次，使用4%多聚甲醛固定细胞，用0.15% Triton透化，然后PBS再次充分洗涤。将细胞与肾上腺素β1受体(β1-adrenergic receptor，β1-AR)、肾上腺素β2受体(β2-adrenergic receptor，β2-AR)(美国Abcam公司)或基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinases 2，MMP-2) (碧云天生物科技)的一抗(1∶100)在室温下孵育1 h。然后，将细胞与二抗(1∶1 000)在室温条件下避光孵育1 h。再次用PBS洗涤，用DAPI(生工生物工程股份有限公司)对细胞进行复染，并用荧光显微镜(日本Olympus公司)观察。

1.6 细胞增殖测定使用CCK-8(Life Technologies)评估细胞活力。将细胞接种于96孔板(每孔1×103个，100 μL)中，将去甲肾上腺素(0、0.1、1、10、100 μmol·L-1)加入孔中，在37 ℃、5% CO2下培养24、48、72 h。向每个孔中加入10 μL CCK-8，温育2 h后，使用Multiskan FC酶免疫测定分析仪(Thermo Fisher Scientific)检测450 nm处的吸光度(OD)。使用对照孔中未处理细胞的吸光度读数进行对比，以获得细胞存活百分比。该实验重复3次。

1.7 细胞迁移实验使用划痕实验确定细胞迁移能力。将MCF-7细胞以每孔2×104个细胞的密度接种到6孔板中，并在无血清的培养基中培养过夜，将细胞分为加入10 μmol·L-1去甲肾上腺素(Sigma公司)组；20 μmol·L-1普萘洛尔(Sigma公司)处理组以及对照组。继续培养24 h后，每孔用PBS洗涤3次。在显微镜下选取视野观察。

1.8 细胞侵袭测定将MCF-7细胞(3×103个)置于上部Transwell小室(24孔板，0.8 μm孔径，Corning Costar公司)上，小室内底面涂抹覆盖Matrigel(Sigma公司)，并加入200 μL无血清的培养液。下室加入500 μL含有10%胎牛血清的DMEM，分为普萘洛尔预处理并加去甲肾上腺素组、10 μmol·L-1去甲肾上腺素组、普萘洛尔组、对照组。在37 ℃温育24 h后，用棉签轻擦上层小室内底面的细胞，用4%多聚甲醛固定下膜表面的细胞，用0.1%结晶紫染色，并在显微镜下计数(Leica公司)。独立进行3次实验并比较结果。

1.9 细胞周期测定将MCF-7细胞按处理方法分为4组：去甲肾上腺素(10 μmol·L-1)、去甲肾上腺素与普萘洛尔同时处理、或普萘洛尔单独处理或不经过处理。然后使用胰蛋白酶消化，离心收集细胞，预冷PBS洗涤2次，4 ℃下在冷冻的70%乙醇中固定过夜。收集固定的细胞，用PBS洗涤2次，悬浮于含有10 mg·L-1碘化丙啶(PI，美国Sigma公司)和100 mg·L-1RNase A的PBS中， 4 ℃避光孵育至少30 min。使用流式细胞仪(Becton-Dickinson FACScan)测定细胞周期分布。

1.10 蛋白提取和蛋白质印迹用含有蛋白酶抑制剂PMSF的200 μL RIPA裂解液裂解MCF-7细胞，收集总蛋白。使用BCA蛋白质测定法测定提取的蛋白质浓度。蛋白上样量30 μg，SDS-PAGE电泳后，转移到PVDF膜上。膜5%脱脂奶粉在室温下封闭1 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗孵育2 h，然后用Trident ECL(碧云天生物科技)显色。

2 结果

2.1 乳腺癌患者的抑郁评估结果对116例乳腺癌患者抑郁的发生率评估结果显示(Fig 1)，48%乳腺癌患者伴有抑郁症状(56/116)，超过国内常模的抑郁发生率。其中轻度抑郁24人，中度抑郁21人，重度抑郁11人。从评分来看，乳腺癌患者SDS的评分为(65.0±3.2)，高于国内常模的评分(42±11)。

Fig 1 High incidence of depressive symptoms in breast cancer patients

2.2 小鼠血清中的去甲肾上腺素浓度与抑郁程度存在正相关为了确定应激模型组与对照组血清之间去甲肾上腺素的差异，对收集的血清样本进行了ELISA检测。Fig 2结果表明，CUMS模型组小鼠血清中的去甲肾上腺素水平较对照组明显升高。经统计分析，造模组小鼠的去甲肾上腺素水平与抑郁程度呈正相关。以上结果提示，抑郁可以促进动物血清去甲肾上腺素水平的提高。

2.3 抑郁症状可以促进乳腺癌的进展如Fig 3所示，在经过不可预见性应激刺激以后，CUMS模型组小鼠的肿瘤体积(2 797±126)mm3,与对照组小鼠肿瘤体积(1 943±224)mm3差异有显著性。表明抑郁作为一个独立因素，可以促进乳腺癌的发展。

2.4 人乳腺癌MCF-7细胞中存在β-ARs的表达为了研究去甲肾上腺素是否直接影响乳腺癌的发展，检测了MCF-7细胞中是否存在β-ARs的表达。Fig 4A的Western blot结果显示，β1-AR和β2-AR均在MCF-7细胞中表达。另外，免疫荧光实验支持这一结果(Fig 4B)。

Fig 2 Serum norepinephrine levels in CUMS model and its relationship with depression severity n=10)

Fig 3 Development of breast cancer promoted by depressive symptoms n=10)

Fig 4 Expression of β-adrenalin receptors in human breast cancer cells n=3)

2.5 去甲肾上腺素可以增强MCF-7细胞的恶性程度，这种增强作用可以被β受体阻滞剂普萘洛尔减弱首先，CCK-8检测结果表明，去甲肾上腺素可剂量依赖性地促进MCF-7细胞的增殖(Fig 5)。Transwell实验检测了MCF-7乳腺癌细胞的侵袭能力，且免疫荧光实验证明经去甲肾上腺素处理后，MMP-2的水平升高，表明去甲肾上腺素可以使肿瘤细胞的侵袭能力增强，而这种增强作用可被普萘洛尔抑制(Fig 6)。在划痕实验中(Fig 7)，观察到去甲肾上腺素对细胞的迁移发挥促进作用，并且这种促进作用可被普萘洛尔明显消除。以上结果表明，去甲肾上腺素可以增加乳腺癌的恶性程度。

Fig 5 Proliferation of MCF-7 cells promoted by norepinephrine n=3)

2.6 去甲肾上腺素促进细胞周期从G期向S期转变为了确定去甲肾上腺素对细胞周期的影响，使用流式细胞仪确定去甲肾上腺素是否会影响DNA合成。如Fig 8所示，去甲肾上腺素可以导致S期细胞积累的增加，G期细胞的积累减少，而用普萘洛尔预处理后，促进细胞从G期转变为S期的作用降低。由于DNA的合成发生在S期，因此，可以认为去甲肾上腺素可以促进DNA合成,但这种促进作用差异无显著性。

2.7 去甲肾上腺素通过p38 MAPK通路刺激MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭为了探明去甲肾上腺素通过何种途径促进MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭，使用Western blot检测了p38 MAPK通路的激活。Fig 9结果表明，去甲肾上腺素处理后，p-p38 MAPK表达量增加，且普萘洛尔可以削弱这一作用，各组p38 MAPK表达则没有差异。因此推测，β-AR的激活可能会提高p38 MAPK信号通路的磷酸化程度。

Fig 6 Invasive ability of MCF-7 cells increased by norepinephrine

3 讨论

有研究证实，30%～70%的肿瘤患者伴有不同程度的抑郁症状[7]。本研究发现，乳腺癌患者中抑郁症状的发生率高于国内常模。为了更好地揭示抑郁对肿瘤是否存在促进作用，我们采用了CUMS模型来模拟临床慢性抑郁，对小鼠皮下荷瘤后的一系列实验结果证实，抑郁一定程度上促进乳腺癌的发展进程。Chang等[8]的研究与本研究涉及的实验相似，且实验结果一致。研究发现，动物血清中抑郁相关激素，即去甲肾上腺素含量明显上升。针对这一结果，我们在细胞层面上进行一系列实验，证实去甲肾上腺素可以促进乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭。研究发现，在黑色素瘤[9]、卵巢癌[10]以及前列腺癌[11]中的相关类似结果。

Fig 7 Migration ability of MCF-7 cells increased by norepinephrine

信号通路方面的相关研究指出，Akt[12]、mTOR[13]可能作为抑郁影响肿瘤的信号通路。本研究证实，p38 MAPK信号通路的特殊性[14-15]，因此可能在抑郁促进乳腺癌进程中发挥重要作用。因此，血清去甲肾上腺素可以作为判断乳腺癌患者抑郁程度的一项指标，提示及时关注患者心理状态，采取积极的处理措施，降低抑郁情绪对乳腺癌的不良影响。然而，在本研究临床部分的研究中，考虑到肿瘤患者疾病进程的特殊性，填写问卷易加重患者的心理负担，与我们研究主旨相悖，因此本研究临床样本量不够大，未来的研究会立足患者角度，适当扩大样本量进行补充研究。

综上所述，心理问题持续存在于乳腺癌的发病、诊断和治疗过程中，不同程度地影响着患者的预后。现有抗肿瘤治疗的理念不断进步及医疗技术的持续更新，可能均无法减少患者经历心理问题带来的持续折磨。心理问题是与治疗过程中的技术性问题无关的独立存在。我们提倡对于存在抑郁症状的乳腺癌患者进行及时的、有针对性的心理干预，本质上是对于乳腺癌完整治疗策略的一种补充。重视乳腺癌患者抑郁症状的临床表现，提高乳腺癌患者抗肿瘤治疗的有效性，无疑将为乳腺癌治疗提供新的思路，这在临床抗肿瘤治疗过程中具有十分重要的现实意义。