异绿原酸A抑制NLRP3炎性复合体/NF-κB活化减轻胶原诱导型关节炎大鼠炎症反应

刘 杨，段学清，严福林，潘 春，吴继春，曹 峰，梁 江

(贵州中医药大学 1. 基础医学院、2. 药学院、3. 第一附属医院风湿免疫科，贵州 贵阳 550025)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)属自身免疫病，以滑膜炎性增生为表现，易致关节肿胀，关节软骨受损伴畸形，初期临床治疗多以积极抗炎治疗，阻止患者关节骨质的破坏，降低致残率。随着对自身免疫性疾病治疗药物的深入研究和对作用靶点的挖掘，如白介素类单克隆抗体、信号通路靶向抑制类药物、生物碱类、多糖类、黄酮类天然药物等，已被开发并部分上市应用临床[1]。异绿原酸A(isochlorogenic acid A)作为奎宁酸与咖啡酸酯化缩合下的天然产物，多存在于忍冬藤、黑骨藤、金银花等植物中，具有一定的抗氧化、抗过敏、抗菌等作用[2]。但有关异绿原酸A对RA药效和机制未有深入报道，本研究拟通过制备胶原诱导型关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，考察异绿原酸A对类风湿关节炎动物模型干预后表现及其潜在抗炎分子机制，为异绿原酸A的开发应用提供资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 SPF级SD大鼠，♂，体质量(200±20)g，购自长沙天勤生物技术有限公司，动物饲养合格证编号为43000200003443。

1.1.2药物与试剂 异绿原酸A(纯度99%)，购自成都德思特生物技术有限公司；白细胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、白细胞介素6(interleukin 6，IL-6)、肿瘤坏死因子ɑ(tumor necrosis factor ɑ，TNF-ɑ)、C反应蛋白(C reaction protein，CRP)、干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)、白细胞介素18(interleukin 18，IL-18)试剂盒，均购自上海通蔚生物科技有限公司；NLRP3抗体(ab214185)、caspase-1抗体(ab1872)、NF-κB p65抗体(ab16502)、核因子κB活化因子受体配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL)抗体(ab239607)、β-actin抗体(ab8226)，均购自Abcam公司；p-NF-κB p65抗体(#3031)、磷酸化核因子κB抑制蛋白ɑ(p-IκB-α)抗体(#2859)，均购自CST公司；完全弗氏佐剂，购自Sigma公司；牛Ⅱ型胶原，购自Chondrex公司；生物素标记山羊抗兔抗体、ECL发光液、苏木精-伊红染色试剂盒，均购自上海碧云天生物技术有限公司；MinuteTM动物细胞/组织总蛋白提取试剂盒，购自北京英文特生物技术有限公司；微量BCA蛋白定量试剂盒，购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.1.3仪器 石蜡病理切片机(浙江金华科迪仪器设备有限公司)；电泳仪、凝胶成像系统(Bio-Rad公司)；数显百分测厚仪(河南华方信息技术有限公司)；电子显微镜(日本奥林巴斯株式会社)。

1.2 方法

1.2.1CIA大鼠模型的制备 SPF级SD大鼠随机分为正常组10只和造模组若干只，根据参考文献造模方式[3-4]，造模前，将胶原与完全弗氏佐剂1∶1混合成乳剂后冰上备用，造模组分别在d 0和d 7尾根部皮下多点注射乳剂0.2 mL，肉眼观察大鼠足趾致炎情况，按评分标准进行模型筛选：0分为双足跖趾无红肿；1分为双足跖趾轻度肿胀；2分为双足跖趾中度肿胀；3分为双足跖趾重度肿胀；4分为足跖趾、踝关节全部肿胀或伴有畸形。评分1分以上即可则随机入组。制备模型成功的大鼠继续随机分配为模型组和异绿原酸A(50、100 mg·kg-1)组，每组10只。之后4组分别灌胃蒸馏水10 mL·kg-1和异绿原酸A 50或100 mg·kg-1，每天1次，连续给药42 d。给药期间动物无死亡，正常饮水饮食，符合贵州中医药大学动物伦理规范。动物称重并测量每组大鼠足跖肿胀厚度后，处死取血；取骨关节，4%多聚甲醛固定；取关节滑膜组织，-80 ℃超低温保存。

1.2.2足跖部肿胀度测量记录 厚度测量仪测量大鼠双后肢诱导前和诱导后每周肿胀度，记录并统计分析。肿胀度=诱导后厚度-诱导前厚度。

1.2.3脾脏脏器系数检测 解剖脾脏称重，记录并计算脏器系数：脾脏系数=脾脏重量÷大鼠体质量。

1.2.4HE染色观察骨关节病理改变 骨关节组织常规脱钙，脱钙完全后自来水冲洗，70%、80%、90%、100%乙醇浸泡24 h，二甲苯浸泡12 h，液体石蜡浸泡12 h，包埋并切片，厚度10 μm，新鲜的二甲苯脱蜡20 min，100%、90%、80%、70%乙醇浸泡10 min，蒸馏水浸泡1 min，苏木精染色10 min，自来水冲洗5 min，伊红染色1 min，70%、90%乙醇浸泡10 min，二甲苯浸泡10 min，盖玻片封片，镜下观察并记录。

1.2.5免疫蛋白印迹法检测关节滑膜内蛋白表达 根据试剂盒说明，提取关节滑膜总蛋白后，BCA法蛋白定量。按试剂盒操作步骤制备浓度12%分离胶和浓度5%浓缩胶，80 V电压电泳2 h后，60 V电压转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭1 h后，加一抗β-actin(1∶6 000)、NLRP3(1∶300)、caspase-1(1∶2 500)，以及NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκB-ɑ、RANKL(1∶500)，4 ℃孵育过夜后，加入二抗(1∶10 000)，室温孵育2 h，TBST冲洗3次，ECL显影液显影，分析结果。

1.2.6ELISA法检测血浆IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18水平 取大鼠血浆，3 000 r·min-1离心15 min，取上层并根据试剂盒要求，制定好标准曲线后，按试剂盒操作步骤进行。

1.2.7数据处理 采用SPSS 20.0统计学软件对数据显著性分析，组间比较采用F检验进行数据分析。

2 结果

2.1 异绿原酸A对大鼠足跖炎性肿胀度的影响Tab 1结果表明，与正常组比较，模型组大鼠足跖肿胀程度明显增大(P<0.01)。异绿原酸A(50、100 mg·kg-1)组大鼠足跖肿胀程度明显减轻，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 异绿原酸A对大鼠脾脏系数的影响Fig 1结果显示，与正常组相比，模型组大鼠脾脏系数增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。不同剂量异绿原酸A可降低模型大鼠的脾脏系数。

Fig 1 Effect of isochlorogenic acid A on spleen organ coefficient in rats n=10)

Tab 1 Effect of isochlorogenic acid A on swelling degree of voix pedis in rats at different time periods n=10)

2.3 异绿原酸A对大鼠骨关节病理的影响Fig 2的HE染色结果显示，正常组骨关节面光滑，软骨细胞排列整齐紧密，关节间隙良好，无赘生物生成。模型组骨关节面消失，软骨细胞排列紊乱，关节间隙消失并融合。给予不同剂量的异绿原酸A可明显抑制骨关节损伤的病理改变。

Fig 2 Effect of isochlorogenic acid A on pathology of bone and joint in rats by HE staining (scale bar=100 μm)

2.4 异绿原酸A对大鼠滑膜NLRP3、caspase-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκB-α、RANKL蛋白表达的影响Fig 3结果显示，与正常组相比，模型组NLRP3、caspase-1、NF-κB p65、p-NF-κB p65、p-IκB-α、RANKL蛋白表达升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。与模型组相比，不同剂量异绿原酸A可降低模型大鼠上述蛋白表达(P<0.01)。

2.5 异绿原酸A对血浆IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18水平的影响Tab 2结果显示，与正常组比较，模型组IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18表达升高。与模型组比较，不同剂量异绿原酸A对血浆中IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18表达均呈抑制作用，差异具有统计学意义(P<0.01)。

Fig 3 Effect of isochlorogenic acid A on expression of NLRP3, caspase-1, NF-κB p65, p-NF-κB p65, p-IκB-α, RANKL in rats synovium

3 讨论

异绿原酸A是一种二咖啡酰奎宁酸类化合物，与绿原酸属同分异构体，在中药金银花、忍冬藤、黑骨藤、菊花等天然植物含量较高。现已证实，异绿原酸A具有保肝抗炎、抗HBV、抑制大肠杆菌增殖等作用[5]。通过在大鼠体内经胶原诱导方式，构建和模拟RA模型分析后发现，胶原刺激后，模型组大鼠足跖部炎症引发的肿胀度明显增加，给予不同剂量的异绿原酸A后，模型大鼠足跖部炎症肿胀程度被明显抑制，表明异绿原酸A具有良好的抑炎药理活性。对模型大鼠免疫器官脾脏进行称重后发现，模型大鼠的脾脏经胶原诱导刺激后有明显肿胀和脏器系数增加表现，给予异绿原酸A后可以改善这种表现，提示异绿原酸A可能对脾脏内免疫细胞的炎性增殖有抑制作用，这种可能需从脾脏内淋巴细胞增殖活性进行下一步的相关探讨。

Tab 2 Effect of isochlorogenic acid A on plasma levels of IL-1β, IL-6, TNF-ɑ, CRP, IFN-γ and IL-18 in CIA rats , n=10)

RA作为自身免疫疾病，炎性反应的过度激活目前被认为是导致RA滑膜增生和骨质破坏的重要诱因。NLRP3炎性复合体与人类多种自身免疫病相关，在中性粒细胞、单核巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞中都有表达，它由NOD样受体家族、凋亡相关斑点样蛋白和caspase-1组成[6-7]。当NLRP3炎性复合体活化后，可剪切前体caspase-1蛋白变为caspase-1，后者进一步刺激IL-1β、IL-18等白介素家族细胞因子活化，而白介素家族蛋白现被证实在RA病程中有重要作用[8-9]。CIA模型大鼠关节滑膜检测发现，异绿原酸A能明显抑制NLRP3炎性复合体在关节滑膜内的表达，进而抑制血浆内白介素家族IL-1β、IL-18的过表达。NF-κB蛋白是目前研究炎症的热门靶点之一，在胞质中与NF-κB抑制蛋白结合，形成无活性聚合体。当炎症信号产生时，胞质中NF-κB抑制蛋白被磷酸化，进一步被降解并释放NF-κB蛋白进入胞核，增强靶基因的转录，增强炎性反应[10-11]。检测CIA模型大鼠关节滑膜内NF-κB蛋白表达发现，异绿原酸A能明显抑制关节滑膜内NF-κB蛋白表达及其磷酸化水平，并抑制NF-κB抑制蛋白ɑ亚基的磷酸化水平，进而抑制了相应炎性反应。

人破骨细胞与成骨细胞可调节骨骼生长发育，并使骨组织更新处于平衡状态，维持正常的骨代谢。如果平衡被打破，破骨细胞多于成骨细胞，体内骨量降低，将难以维持骨骼的强度和弹性。TNF家族与NF-κB蛋白关系密切，RANKL属于TNF家族成员，其主要作为破骨细胞表面上RANK受体，与相应配体结合，促进破骨细胞成熟和分化。TNF-α、甲状旁腺激素等可促进RANKL过表达[12-14]。在RA患者体内，由增殖活化的T细胞和成纤维细胞等释放IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ、CRP等一系列因子，导致RANKL大量释放，激活并促进破骨细胞分化与成熟，导致体内破骨细胞大量生长，成骨细胞减少，引发体内骨量丢失，继而诱发关节骨组织缺损。CIA模型大鼠经异绿原酸A干预后，血浆IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18均表达下调，炎症级联反应被明显抑制，关节滑膜内的RANKL蛋白的过表达被明显抑制，骨关节病理显示，骨关节破坏征象明显减轻，表明异绿原酸A可能抑制滑膜内RANKL蛋白和其他炎症因子的表达，减轻CIA模型骨关节的损害程度。

综上，本研究明确了异绿原酸A可抑制大鼠关节滑膜内NLRP3、caspase-1、NF-κB p65、RANKL蛋白过表达、降低p-IκB-ɑ和NF-κB p65蛋白的磷酸化水平，抑制血浆IL-1β、IL-6、TNF-ɑ、CRP、IFN-γ、IL-18水平，进而减轻CIA大鼠的炎症反应。