活性免疫球蛋白蛋黄粉增强小鼠抗疲劳性能的实验研究*

户茗珈 彭 雨 李 栋 刘毓婉 李 颖 翟 静 刘永庆 王 涛

1.山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271000；2.潍坊康奥思生物技术有限公司，山东 潍坊 261000

随着社会高速的发展，生活节奏的加快、工作压力的增大,人们的机体与心理往往处于高度紧张的状态，因此疲劳越来越成为影响人们生活质量的重要因素[1]。疲劳作为一种在脑力或体力活动到达一定阶段时出现的正常的生理现象，是指机体生理过程不能持续其机能在特定水平或整体不能维持预定的运动强度而出现的一种状态[2]，可以引起机体运动能力降低、差错事故增多、工作效率降低、战斗力减退、反应迟钝、动作协调性降低[3]。疲劳发生后如果长时间没有得到消除，就会逐渐积累,还会导致“过劳”、“慢性过疲劳综合征”和“过度训练综合症”等症状出现，使机体内分泌发生紊乱、免疫力出现下降,甚至还有器质性疾病的改变,威胁人类身心健康[4]。因此如何有效的缓解机体疲劳和促进疲劳的恢复也成为社会上越来越关注的焦点。

目前研究认为，免疫球蛋白主要是在抵抗细菌、病毒等病原体入侵,增强机体免疫能力，以及杀伤靶细胞、中和毒素、杀死肿瘤细胞等方面发挥着重要作用。但关于免疫球蛋白在动物体内发挥代谢调节功能、增强抗疲劳功效尚未见报道。

本实验利用研究团队前期从免疫鸡蛋黄中经低温制备的活性免疫球蛋白蛋黄粉，进一步探索活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠抗疲劳作用的影响，为抗疲劳新产品的开发提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

成年雄性昆明种小鼠96只，平均体重(24±2)g(泰邦生物科技公司提供)。活性免疫球蛋白蛋黄粉(注:低温制备的免疫球蛋白蛋黄粉)和缺乏活性免疫球蛋白的蛋黄粉(普通蛋黄粉)(注:常规180°C以上高温瞬间喷雾干燥方法制备的蛋黄粉)均由潍坊康奥思生物技术有限公司提供。血尿素氮(BUN)测试盒、全血乳酸(LD)测试盒、糖元测试盒、丙二醛(MDA)测试盒均购自南京建成生物工程研究所。UV754分光光度计(上海第三分析仪器厂)，DK-8D型电热恒温水槽，有机玻璃材质的50 cm×50 cm×50 cm游泳箱。

1.2 方法

1.2.1活性免疫球蛋白的效价测定 分别对活性免疫球蛋白蛋黄粉、普通蛋黄粉和生理盐水进行抗鸡新城疫病毒(NDV)和禽流感病毒(AIV)血清型H9抗原血凝抑制抗体(HI)效价的测定[5]。取活性免疫球蛋白蛋黄粉和普通蛋黄粉各1 g，充分溶解到10 mL生理盐水中，然后分别取50 μL在96孔V型版上做递倍稀释，每孔再加入同体积的4单位抗原，混匀，置37℃中和1 h。抽取公鸡血液，2 000 r/min离心5 min，去上清及表层白细胞，生理盐水冲洗红细胞，继续以上述条件离心，如此反复洗涤红细胞3～5次收集红细胞，以生理盐水制成1%的红细胞悬液。抗原与样品中和后加入1%的红细胞悬液，置37℃ 40 min后观察结果。

1.2.2小鼠分组及饲喂方法 将96只小鼠适应性喂养1 w后，按体重随机分为4组，设低浓度组(活性免疫球蛋白蛋黄粉)、高浓度组(活性免疫球蛋白蛋黄粉)，蛋黄粉对照组(普通蛋黄粉)和空白对照组 (蒸馏水)，每组24只，每次实验从对应分组中随机抽取8只。组间体重差异无统计学意义。适应性饲养观察5 d后灌胃相应受试物，低、高浓度组分别以50 mg/(kg·d)、100 mg/(kg·d)的活性免疫球蛋白蛋黄粉溶液灌胃，蛋黄粉对照组以100 mg/(kg·d)的缺乏活性免疫球蛋白的蛋黄粉溶液灌胃，空白对照组以同体积蒸馏水灌胃。实验期间小鼠自由饮水及摄食，连续灌胃15 d后进行各项抗疲劳指标的测定。实验开始及结束时用电子秤称量小鼠体重。

1.2.3小鼠力竭游泳实验 末次灌胃30 min后，各组随机抽取8只小鼠，于鼠尾根部固定其体重5%铅皮，放入水温为(30.0±2.0)℃、水深30 cm的恒温游泳箱中，每个水箱1次放入4只小鼠。将小鼠头部沉入水中10 s内不返回水面视为力竭，用秒表记录自游泳开始至力竭死亡的时间，即小鼠的游泳时间[6-7]。

1.2.4小鼠全血乳酸测定 末次灌胃30 min后，各组随机抽取8只小鼠，眼眶采血0.1 mL，然后负重游泳(负体重的4%)10 min，休息30 min后再次眼眶采血0.1 mL。试管编号，各管加入0.6 mL蛋白沉淀剂混匀，3 500～4 000 r/min离心10 min，取上清液进行测定，具体步骤按相应试剂盒说明书操作。

1.2.5小鼠血清尿素氮测定 末次灌胃30 min后，各组随机抽取8只小鼠，于30℃的水中无负重游泳90 min，捞出小鼠擦干，休息30 min后拔眼球采血约0.5 mL(不加抗凝剂)。放入4℃冰箱中约3 h，全血凝固后2 000 r/min离心15 min，取血清备用。血清中的尿素氮与二乙酰肟反应生成红色物质，根据色泽深浅来计算尿素氮含量，具体步骤按相应试剂盒说明书进行。

1.2.6小鼠运动后肝糖原测定 末次灌胃30 min后，各组随机抽取8只小鼠，于30℃的水中无负重游泳90 min，捞出擦干休息30 min后立即脱颈处死小鼠，取新鲜肝脏标本经生理盐水漂洗后，滤纸吸干，称重；按样本重量(mg)∶碱液体积(μL)=1∶3，一起加入试管中，沸水浴煮20 min，流水冷却；将糖原水解液进一步制备成糖原检测液，具体步骤按相应试剂盒说明书进行。

1.2.7小鼠肝脏丙二醛测定 末次灌胃30 min后,各组随机抽取8只小鼠，脱颈处死小鼠，取新鲜肝脏标本经生理盐水漂洗后，滤纸吸干，称重；加入9倍生理盐水制成10%的组织匀浆，2 500 r/min离心10 min，去上清液进行测定，具体步骤按相应试剂盒说明书进行。

1.3 统计分析

2 结 果

2.1 活性免疫球蛋白的效价测定

抗NDV和AIV血清型H9抗原血凝抑制抗体(HI)效价的测定(log2)如表1，结果显示：活性免疫球蛋白蛋黄粉对NDV和AIV血清型H9两种抗原的血凝抑制抗体(HI)效价均很高，分别为达到log2的7和9，但在普通蛋黄粉和生理盐水对照组均未检测到抗体(表1)。

表1 抗NDV和AIV血清型H9两种抗原的血凝抑制抗体(HI)效价的测定(log2)

2.2 活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠体重的影响

比较空白对照组与实验组小白鼠实验前后(14 d)体重增长的情况，实验组和空白对照组小白鼠体重都呈现出增长的态势，且各组之间没有显著性差异(P>0.05)，说明活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠体重没有显著影响(见表2)。

表2 活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠体重的影响

2.3 活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠负重游泳的影响

空白对照组、蛋黄粉对照组、低浓度组和高浓度组小鼠负重游泳时间分别为(450.38±44.48)、(482.10±72.16)、(519.25±109.99)、(3059±885.41)s，实验组与空白对照组比较，小白鼠负重游泳时间明显延长，高浓度组尤为显著，各实验组与空白对照组对比差异显著(P<0.05或P<0.01)。表明活性免疫球蛋白蛋黄粉可以明显延长实验小白鼠的负重游泳时间，即能够有效提高小白鼠的运动耐受能力。

2.4 活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠运动前后全血乳酸的影响

在运动前，空白对照组、蛋黄粉对照组、低浓度组和高浓度组4个组的乳酸含量无明显差异。运动后空白对照组、蛋黄粉对照组、低浓度组和高浓度组全血乳酸分别升高了103.1%、116.9%、90.4%、73.2%。实验组与空白对照组对比差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。由结果表明，活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠运动后乳酸的消除有明显作用，可以消除疲劳(见表3)。

表3 活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠运动前后全血乳酸的影响(mmol/L)

2.5 活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠运动后血清尿素氮的影响

蛋黄粉对照组、低浓度组和高浓度组血清尿素氮均低于空白对照组，差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。其中蛋黄粉对照组、低浓度组、高浓度组血清尿素氮含量比空白对照组下降18.7%、13.8%、34.4%。实验结果表明，普通蛋黄粉和活性免疫球蛋白蛋黄粉均可以降低小鼠运动后所产生的血清尿素氮，抗疲劳作用明显(见表4和图1)。

表4 活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠运动后血清尿素氮的影响(mmol/L)

图1 活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠运动后血清尿素氮的影响

2.6 活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠运动后肝糖原的影响

实验组肝糖原含量明显高于空白对照组，蛋黄粉对照组、低浓度组、高浓度组与空白对照组比较差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，蛋黄粉对照组、低浓度组、高浓度组分别比空白对照组肝糖原浓度提高43%、78%、45%。结果表明，普通蛋黄粉和活性免疫球蛋白蛋黄粉均可提高小鼠肝糖原储备，延缓疲劳发生；低浓度活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠运动后肝糖原下降具有更明显的抑制作用，其机制有待进一步研究(见表5和图2)。

表5 活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠运动后肝糖原的影响(mg/g)

图2 活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠运动后肝糖原的影响

2.7活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠肝脏丙二醛含量的影响

与空白对照组比较，蛋黄粉对照组及低剂量组丙二醛增高显著(P<0.05或P<0.01)，高剂量组丙二醛水平与空白对照组没有明显变化。由结果表明，活性免疫球蛋白蛋黄粉对防止小鼠丙二醛堆积，减轻细胞氧化受损有一定的意义(见表6和图3)。

表6 活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠肝脏丙二醛含量的影响(mmol/L)

图3 活性免疫球蛋白蛋黄粉对小鼠肝脏丙二醛含量的影响

3 讨 论

疲劳是涉及多种生理生化因素的综合过程，是体力或脑力活动到一定程度时机体必然会产生的一种正常生理现象，抗疲劳效果包含延缓疲劳的产生和加快疲劳的消除。运动、生活、工作过程中，疲劳的发生不可避免，针对疲劳问题，传统的药物干预，可能对机体造成毒副作用。补充营养元素对疲劳进行干预，是一种安全无毒副作用的有效措施。运动过程中合理改善饮食，增加营养素的摄入，如蛋白质、碳水化合物或脂肪酸等，可产生一定的抗疲劳效果。

本实验采用成年雄性昆明种小鼠作为运动疲劳模型，利用免疫鸡蛋黄制备的活性免疫球蛋白蛋黄粉和常规提取方法提取的蛋黄粉作为对照，进行灌胃干预，测定小鼠负重游泳力竭时间，检测血乳酸、尿素氮、肝糖原、丙二醛等生化指标的变化，探讨从免疫鸡蛋黄中制备的活性免疫球蛋白蛋黄粉对游泳小鼠的抗疲劳作用，实验结果表明，灌胃活性免疫球蛋白蛋黄粉组小鼠比灌胃普通蛋黄粉小鼠能够大幅度延长游泳力竭时间，减少血清中乳酸、肝脏丙二醛和尿素氮含量，提升肝糖原含量，这有利于延缓小鼠的疲劳发生，提高其运动耐力，发挥抗疲劳的作用。

运动耐力的提升是抗疲劳能力增强最直接、客观的指标，负重游泳实验装置简单，并能够直观地获取实验结果，被认为是重要的抗疲劳实验指标之一[8-9]。本研究显示：低浓度和高浓度2个剂量，能够提高小鼠的运动能力，改变小鼠运动过程中的代谢状态，改善运动过程中的能量供给，特别是高浓度组能显著延长小鼠的游泳力竭时间，即能够有效提高小鼠的运动耐受能力。高浓度组小鼠大幅度延长游泳力竭时间的机制是否存在活性免疫球蛋白蛋黄粉对代谢环节的特殊调节或其他生理功能的调节，有待进一步研究。

组织缺氧时可导致机体三羧酸循环速率下降，使丙酮酸进入有氧氧化发生障碍，由NADH+H+提供氢，乳酸脱氢酶催化丙酮酸还原成乳酸，导致机体乳酸增多。血乳酸过多将使体液呈酸性，进一步影响细胞顺利摄取营养和氧气，使细胞的正常功能受到影响。堆积的血乳酸会使肌肉发生收缩，因而挤压血管，使得血流不畅，使肌肉功能下降，产生疲劳。因此，血乳酸被认为是影响运动性疲劳的重要因素，可作为评判机体疲劳程度的指标；减少血乳酸的产生和加快乳酸的分解可以反映疲劳的产生和消退[1]。本研究结果显示活性免疫球蛋白蛋黄粉可减少乳酸堆积，有效延缓运动过程中的疲劳。

血清尿素氮是血浆中除蛋白质以外的一种含氮化合物，由蛋白质和氨基酸最终代谢而成。机体在进行长时间运动过程中，因为不能从糖类、脂肪分解获得足够的能量，蛋白质和氨基酸分解则会加强以满足机体能量供应，因此机体内的血清尿素氮会有所增加。由于机体剧烈运动后体内血清尿素氮含量会明显增加，所以测定血清尿素氮可以作为评判疲劳程度的指标[2]，以反映机体肌肉蛋白质和氨基酸的代谢状况。我们的检测结果表明，持续灌注高浓度活性免疫球蛋白蛋黄粉，能更有效地减少体内蛋白质的氧化分解，从而减少含氮废物尿素氮的产生，有利于运动过程的持续进行，低浓度的活性免疫球蛋白蛋黄粉反而使尿素氮稍有升高，其机制有待进一步研究。

肝糖原是肝脏中葡萄糖聚合物，在机体需要时可以转化为葡萄糖而供能。脑组织在正常饮食情况下所需能量主要来自葡萄糖，而脑组织葡萄糖几乎全部来自血糖，当血糖降低时可以引起疲劳。当机体进行剧烈运动时，各组织消耗葡萄糖均增多，骨骼肌消耗肌糖原增多，导致血糖水平降低，而肝糖原释放葡萄糖入血维持血糖平衡。若肝糖原储备量降低，不能维持血糖平衡，则会导致疲劳的发生[3]。本研究表明，灌胃活性免疫球蛋白蛋黄粉与普通蛋黄粉后，均具有增加糖原储备，延缓疲劳的作用。

丙二醛(MDA)是脂质过氧化的主要代谢产物。体内某些物质代谢过程及某些外源性药物或毒物在体内代谢过程中产生的自由基，可引起脂质发生过氧化作用产生MDA等醛类物质，进而作用于脱氧核糖核酸(DNA)、膜蛋白和酶等发生交联反应，使膜通透性增加，导致细胞膜结构、功能和代谢发生改变，这对细胞具有严重的损害作用。近年在研究中发现，脂质过氧化作用对于某些疾病的发生发展起到一定作用。因此，对体内MDA含量的测定在一定程度上可以反映体内脂质过氧化程度，体现了细胞或机体受损程度，对于监测身体状况、疲劳程度、研究某些疾病或药物的作用，具有一定的价值[10]。本研究检测结果表明，与空白对照组比较，蛋黄粉对照组及低浓度组小鼠丙二醛含量有所升高，而高浓度组小鼠丙二醛水平与空白对照组没有明显变化，其原因可能是由于灌胃使小鼠产生的应激导致丙二醛含量升高，而持续灌注高浓度活性免疫球蛋白蛋黄粉，又防止丙二醛堆积，减少体内脂质过氧化，减轻细胞或机体氧化受损，具有延缓疲劳发生的作用。

综上所述，通过低温制备的活性免疫球蛋白蛋黄粉，能够改变小鼠运动过程中的代谢状况，改善运动过程中的能量供给，明显提高小鼠运动耐受能力，并减少乳酸、丙二醛等代谢产物的堆积，减少机体对蛋白质的过度消耗，增加肝糖原储备，为运动过程持续供给能量，延缓疲劳的发生，提高小鼠的运动能力，发挥抗疲劳的作用。

致谢“特异性免疫球蛋白功能性检测技术方法的建立与功效测定”资金来源于潍坊康奥思生物技术有限公司，在此表示真诚的感谢。