解淀粉芽孢杆菌HAB-9的鉴定及对17株植物病原菌的拮抗作用①

陈 照 李培征 刘惠芳 李秀芳 刘文波③ 秦春秀③

(1海口市秀英区农林局 海南海口570100;2海南大学植物保护学院/热带农林生物灾害绿色防控教育部重点实验室 海南海口570228)

芽孢杆菌（Baci l lussp.）是人们熟知的一类重要的生防微生物，在自然界分布广泛，具有生长速度快、营养需求简单、较强的耐热性和抗逆性、在植物表面易于存活与繁殖等特性［1]。芽孢杆菌代谢产物较为丰富，如脂肽类、多糖、磷脂类、聚酮类、多烯类物质等［2]，部分菌株还可以分解土壤中的不溶性磷酸盐；对人畜无害，不污染环境，作为生防菌，具有施用方便，能为农业可持续发展提供帮助［3]；一些种类的芽孢杆菌不仅有防病作用，还能促进植物增产，也可以改善植物根际周围环境，刺激和调控植物生长，抑制植物的病害发生［4]，包括根部病害、枝干病害、一些植物的立枯病菌、黄萎病菌、炭疽病菌等［5]。

解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）与枯草芽孢杆菌（B.subt i l is）是两类重要的生防细菌，亲缘性很高［6]，许多表型特征非常相似，仅通过形态、培养特征及其生理生化很难区分，只有通过进一步基因序列比较才能将两者区分开来［7]。解淀粉芽孢杆菌是一种好氧的革兰氏阳性杆状细菌；有大于菌体的次末端芽孢；芽孢卵圆型，孢囊膨大；最适生长温度为28～30℃，最适生长pH为6.5～7.0。它具有还原硝酸盐；水解淀粉；可利用D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，甘露醇，D-木糖作为碳源；接触酶阳性；氧化酶阴性等生理生化性质［8]。

B.amyloliquefaciensHAB-9菌株是从海南省儋州市两院槟榔土中分离筛选得到，室内研究表明，其对槟榔炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）等17株植物病原真菌均具有拮抗活性。本文对它进行16S rDNA鉴定，并对其生化特征测定及抑菌谱进行研究，为实现该生防细菌的抑菌机理提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试细菌、真菌

供试细菌：HAB-9，从槟榔树根际土壤中分离保存。

供试真菌：所有菌株均由海南大学植物保护学院分子植物病理学实验室提供，并经单孢分离纯化后备用，见表1。

表1 供试植物病原真菌

1.1.2 培养基

LB固体培养基：酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化钠10 g，琼脂16 g，蒸馏水定容至1 000mL，pH7，121℃蒸气灭菌20min。

PDA固体培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉16 g，蒸馏水定容至1 000mL，121℃蒸气灭菌20min。

M.R、V-P测定培养基：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，氯化钠5 g，蒸馏水定容至1 000mL，pH 7～7.2，每管分装4～5 mL，然后在115℃蒸气灭菌30min。

解淀粉培养基：在肉汁胨中加0.2%可溶性淀粉，蒸馏水定容至1 000mL，分装三角瓶，121℃蒸气灭菌20min，倒平板备用。

1.1.3 主要仪器

灭菌锅（HVE-50），电子天平（OHA），显微镜（OLYMPUS），恒温摇床 （Innova4230），移液枪（eppendor f），制冰机 （SANYO），恒温水浴锅（Polscience）， HH-B11恒温培养箱，PCR仪（eppendor f），分光光度计（penk），凝胶成像系统（北京六一），电泳仪（北京君意），微波炉（格兰仕）等。

1.2 方法

1.2.1 生防细菌的分子生物学鉴定

从划线培养的平板上挑取HAB-9单菌落接种到100mLLB液体培养基中，28℃，200 r/min振荡培养 过 夜 。 27F： 5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’引物进行PCR扩增，引物由深圳华大基因股份有限公司合成。反应体系：25µL体系中含有10×PCRbuf fer 2.5 µL，dNTPs 2.0 µL，27F 1.0 µL，1492R 1.0 µL，菌液1.0µL，Trans Taq酶 0.2µL，ddH2O 17.3 µL。反应条件：94℃ 5 min，94℃ 1 min，50℃ 30 s，72℃ 2min，30个循环；72℃ 10min［9]；PCR产物，经1%琼脂糖凝胶电泳胶回收后，连接到pMDTM18-TVector载体，转化到感受态细胞DH5α。筛选阳性克隆送上海生工基因股份有限公司进行测序。

1.2.2 HAB-9菌株的生化特征测定

进行M.R测定、V-P测定、淀粉水解、氧化酶测定、接触酶测定等［10]，并对其进行革兰氏染色［11]。

1.2.3 HAB-9菌株对植物病原真菌的拮抗作用

采用平板对峙培养法进行生防菌对多种病原真菌的拮抗作用测定。在PDA培养基中心接种直径4.0mm的病原真菌的菌饼，在距中心25.00mm的成正方形的4个点分别接种待测菌株，各处理4个重复，置于28℃黑暗培养，待对照组病原真菌长满整皿后，观察处理组有无抑菌圈及抑菌圈的大小，分别测定处理组及对照组的菌落直径，计算抑菌率。抑制率=

1.2.4 数据分析

所有试验均重复4次，数据采用Excel 2016、SPSS19.0和SAS9.2进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 HAB-9菌株的分子生物学鉴定

2.1.1 PCR产物回收

PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳检测，获得约为1 500 bp大小的片段PCR电泳产物及回收（图1）。

图1 HAB-9菌株PCR扩增产物电泳图

2.1.2 转化子的菌落PCR检测

随机挑取5个白色菌落培养菌液为模板进行PCR扩增，PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。所挑选的转化子均扩增得到1 500 bp左右的条带，为阳性克隆（图2）。

2.1.3 序列分析

挑选阳性克隆，送往深圳华大基因公司测序，并对测序结果进行分析。经NCBI的Blast搜索16SrDNA进行比对，并通过DNAstar软件构建系统进化树（图3）。结果显示HAB-9为解淀粉芽孢杆菌，与其遗传距离最近的登录号为AB813716.1。

图2 HAB-9菌株ITS结果PCR

2.2 HAB-9菌株的生理生化测定

2.2.1 革兰氏染色

由图4可知，HAB-9菌株革兰氏染色为深紫色，呈阳性。

2.2.2 M.R测定及V-P测定

由图5可知，M.R测定，HAB-9菌株呈阴性；V-P测定，HAB-9菌株呈阳性。

2.2.3 氧化酶及接触酶测定

HAB-9菌株氧化酶测定均呈阴性，接触酶测定呈阳性。

2.2.4 淀粉水解

由图6可知，解淀粉测定，HAB-9中间均形成明显的透明圈，有解淀粉功能。

2.3 HAB-9菌株的抑菌作用测定

采用平板对峙法培养后，经后期统计处理，结果如下：HAB-9菌株对17种植物病原真菌的抑菌作用见图7，通过计算HAB-9菌株对各真菌的平均抑制率。进行比较（表2），表明HAB-9菌株对17种病原真菌的抑菌率存在差异，主要对炭疽病菌有很好的抑菌效果。

图3 HAB-9菌株16srDNA比对及进化树

3 讨论与结论

对解淀粉芽孢杆菌HAB-9菌株进行了16S rDNA鉴定、生化特征测定及对17种病原真菌的拮抗作用的研究。通过序列分析，HAB-9菌株与解淀粉芽孢 杆 菌 （B.amyloliquefaciens）（GenBank NO.GQ169782.1）的相似度为99%，初步推断为解淀粉芽孢杆菌；经革兰氏染色、M.R测定、V-P测定、淀粉水解、氧化酶测定、接触酶测定，都符合解淀粉芽孢杆菌的特性［10]，可以认定为解淀粉芽孢杆菌。

图4 革兰氏染色

图5 M.R测定和V-P测定

图6 解淀粉测定

芽孢杆菌对植物病原真菌的拮抗作用很多人已经做过，常用的方法有抑菌圈法、对峙培养法、摇瓶菌丝生长抑制法等［8]。不同的方法存在着优缺点，本实验中采取了平板对峙培养法测定了HAB-9对17株植物病原真菌的拮抗作用。实验结果表明HAB-9对17种不同植物病原真菌均有不同程度的拮抗作用，发现HAB-9对槟榔炭疽病（C.gloeosporioides）有较好的拮抗作用，其抑菌率为70.59%；效果最差的为来自海南保亭橡胶树棒孢霉落叶病菌C.cassiicola），抑菌率为50.22%。

表2 HAB-9菌株对17种病原真菌抑菌率统计结果（%）

根据实验结果来看，解淀粉芽孢杆菌HAB-9在实验中对炭疽病菌及其他植物病原菌有抑制作用，抑制率都超过了50.00%，对不同种炭疽病菌抑制程度不一样，特别是对槟榔炭疽效果最好。解淀粉芽孢杆菌可以开发为生防菌，研究成生物农药，但是要将一种生防菌开发成一种商品就要考虑到生产成本问题，还有开发成商品之后在田间的使用效果等。据有关文献记载，虽然芽孢杆菌的研究已经取得了很大的进步，但仍存在着一些问题。解淀粉芽孢杆菌属于芽孢杆菌属，将其开发成生物农药一样要面临着这些问题，诸如：（1）生产成本：生防菌与化学农药相比分泌量比较低，生产周期比较长，这些因素都相应地增加了生产成本。（2）应用问题：将生物杀菌剂投入田间使用，生防菌的性能可能会受到田间微生物、温度、pH值等因素影响而发生变化作用，从而影响抑菌性能；生防菌与土壤本身存在的微生物的排斥；另外田间存在的农药不适宜生防菌的繁殖［12]。

然而，当今世界随着分子研究技术和科学技术的提高，解淀粉芽孢杆菌的基因功能更多的被了解，诸如上面所提到的一些问题势必也能一一解决，解淀粉芽孢杆菌开发成生物农药会被广泛地应用。将更多生防菌开发成生物农药也是历史发展的必然趋势。用不同的生防菌联用，以增强其生防效果［13]，从而充分发挥生防菌的优势，为农业生产提供保障，造福人类。

图7 HAB-9菌株对17种病原菌抑菌作用