‘增城蜜菊’茎尖培养脱毒技术①

何旭君 赵 静 赖增哲 罗晶晶 张华通③

(1广东生态工程职业学院 广东广州510520;2广州田园牧歌农林有限公司 广东增城511300)

菊 花 （Chrysanthemum×morifol iumRamat.）为菊科菊属植物的干燥头状花序。具有疏风散热、清肝明目、解疮毒的功效。现代药理试验证明，菊花具有改善心血管功能、抗癌、抗菌、扩血管、抗氧化等作用［1]。2015版《中国药典—I部》中，菊花被收录为药食同源植物，具有较高的经济价值［2]。由于它可以在林间地头、山坡地种植，近年来也成为一种重要的林下经济植物，被广泛应用。《本草纲目》中有“菊之品九百种”的记载，其中杭菊、亳菊、滁菊、怀菊最为有名，有“四大名菊”之称。‘增城蜜菊’是广州田园牧歌农林有限公司引种徽州亳菊，并从中选育出的良种。亳菊是菊花中的珍品，2014年被中国农业农村部登记为地理标志性农产品，亳菊疏风散热、解暑明目，多为春、夏两季用药，历年来为中医首选的菊花品种［3]。

菊花通常以嫁接、扦插、分株的方式进行无性繁殖，长期的这种营养繁殖会使病毒积累，日趋严重，造成生长不良，品质和产量也随之下降，影响经济效益。据国内外报道，侵染菊花的病毒多达20多种，其中菊花B病毒（Chrysanthemum virus B，CVB）和番茄不孕病毒（Tomatoaspermy virus，TAV）为侵染、危害菊花的优势病毒［4-5]，受感染的植株表现为矮小，花朵畸形、褪色、变小，甚至皱缩、扭曲、枯斑、坏死等，严重地减少了菊花的产量、降低了菊花的品质。‘增城蜜菊’在栽培种植的过程中，也表现出这两种病毒侵染的症状，花朵变小或花形残缺等，极大地影响了产量和品质。为了良种的推广和应用，势必要对种苗进行脱毒，获取脱毒苗。

目前，植物脱毒的方法主要有茎尖培养脱毒法、热处理脱毒法、化学脱毒法等［6]。这些脱毒方法各有利弊，在菊花无毒苗生产中都有应用［7-9]。为获得‘增城蜜菊’的脱毒苗，本研究利用‘增城蜜菊’组培苗为材料，进行微茎尖组培脱毒，总结出一套菊花组织培养微茎尖脱毒技术，以利于‘增城蜜菊’的进一步推广应用。

1 材料与方法

1.1 材料

以‘增城蜜菊’的组培苗作为茎尖脱毒材料。

1.2 方法

1.2.1 组培苗的获得

以广州田园牧歌农林有限公司选取出的‘增城蜜菊’优株而表现轻微带毒病征的植株，采其顶芽为外植体，用0.1%的HgCl2溶液表面消毒7 min，无菌水冲洗5次。将消毒好的材料切成约1.5 cm长的小段（带有1～2个腋芽）接种到MS＋6-BA 1.0 mg/L＋蔗糖30 g/L的诱导培养基进行不定芽诱导，将诱导形成的芽转入MS＋NAA 0.1mg/L＋蔗糖30 g/L培养无菌组培苗。

1.2.2 茎尖切取

在超净工作台内，选取健壮组培苗，将苗取出放在已消毒品的培养皿中，在体视显微镜下进行茎尖剥离，直到出现圆滑生长点时，用灭过菌的解剖刀分别切取0.5、1.0、1.5、2.0mm茎尖，每处理分别切取50个茎尖，接种于微茎尖不定芽诱导培养基中培养，诱导成功的不定芽继续转到MS＋6-BA 2.0mg/L＋蔗糖30 g/L进行继代增殖培养，统计茎尖成活率。重复3次试验。

1.2.3 微茎尖诱导

以MS为基本培养基，采用两种茎尖诱导培养基，JH7：MS＋6-BA 0.1mg/L＋椰子汁100mL/L＋蔗糖30 g/L，JH6：MS＋6-BA0.1mg/L＋蔗糖30 g/L。将不同长度茎尖分别接种于诱导培养基JH7和JH6两种培养基后，放入培养室进行培养，诱导不定芽，统计茎尖诱导率。诱导成功的不定芽继续转到MS＋6-BA 2.0mg/L＋蔗糖30 g/L进行继代增殖培养，诱导芽丛。将芽丛单芽切下接种到生根培养基MS＋NAA 0.1mg/L＋蔗糖30 g/L，获得完整的植株。培养室温度为（25±2）℃，光照2 500～3 000 lx。

1.2.4 脱毒苗检测

根据NCBI GenBank（The Nat ional Center for Biotechnology Information）中收录的菊花B病毒（CVB）和番茄不孕病毒（TAV）的基因序列，应用Primer premier5.0软件，分别设计相应引物，NCBI Primer BLAST在线设计引物。根据已有的菊花CVB、TAV病毒的基因序列各设计一对引物，CVB-F：ggcagaagaagcgaacccta；CVB-R：ccct t tggggtct tggtagc，扩增产物385 bp和TAV-F：catcctccccgt tggaaaga； TAV-R： aacaagctcgggtcacctac，扩增产物408 bp，引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。使用Invit rogen公司Trizol试剂盒，按其使用指导书提取总RNA。使用 TransScript®Al l-in-One First-St rand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒合成cDNA，Taq酶，10×EXTaq Buf fer，2.5 each dNTP均购自Takara。PCR反应在20μL体系中进行：10×EX Taq Buf fer 2μL，2.5 each dNTP 1.6μL，前后引物各0.6μL，无菌水14.58μL，EX Taq酶0.12 μL，cDNA 0.5μL，加完样后混匀后于PE 9600扩增仪上完成如下的PCR循环反应：94℃2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s； 72℃ 45 s， 94℃ 30 s ，60℃30 s；72℃45 s循环30次；最后72℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖电泳后，于凝胶成像系统下观察。

2 结果与分析

2.1 脱毒单株的诱导

在体视显微镜下切下幼小的微茎尖（顶端生长锥）接种入培养基，微茎尖能够较快的适应培养环境，在诱导培养基上生长约1周左右就开始生长膨大（图1-A）。随着，茎尖继续生长，叶长出形成芽苗，40 d左右可长高达2～3 cm（图1-B），观察其诱导率。把形成的芽苗转入丛芽诱导培养基，经25 d左右培养，即可诱导形成丛芽（图1-C），此时，采样进行脱毒效果检测。如果将芽丛单芽切下接种到生根培养基，放入培养室培养，7 d左右开始生根，20～25 d左右就可以得到完整的植株（图1-D）。

2.2 培养基类型和茎尖大小对微茎尖诱导的影响

将获取的不同长度茎尖分别接种于诱导培养基JH7和JH6培养基上，放入培养室培养40 d后记录存活的茎尖数和生长表现情况。如表1所示，采用JH7培养基的微茎尖平均存活数在26.33～43.67，平均诱导率都在50%以上，最高达到了87.33%，诱导效果较好，诱导成功的微茎尖大部分出现绿色小点，开始萌发。而采用JH6培养基的微茎尖，存活数在13.00～36.33，平均诱导率从26.00%到72.67%。方差分析表明，JH7培养基的诱导效果显著高于JH6，表明在培养基中加入椰子汁，可以显著的提高‘增城蜜菊’微茎尖的存活数和诱导率。

图1‘增城蜜菊’微茎尖生长成苗过程

微茎尖的大小显著影响了其存活数和诱导率。如表1所示，在JH7、JH6培养基上都有着相同的趋势，随着所取茎尖的长度的增加，平均存活数和平均诱导率都在显著增加。在JH7和JH6培养基中，取2.0mm茎尖时的平均诱导率是取0.5mm茎尖时的1.66倍和2.79倍，表明所取的茎尖越大越有利于茎尖的存活和诱导。

表1 培养基类型和茎尖大小对微茎尖诱导的影响

2.3 脱毒苗的病毒检测

随机选取2株‘增城蜜菊’的母株进行TAV和CVB病毒检测，结果这两株植株里都带有TAV和CVB病毒图2。

对不同大小的微茎尖诱导成的苗，进行RTPCR病毒检测，发现当茎尖大小为1.0、1.5、2.0 mm时，所获得植物，脱毒情况不稳定，有时能检测出其中一种病毒，有时甚至两种病毒都能够检测到，脱毒不彻底，但当切取的茎尖为0.5mm时，所获得植株的TAV和CVB病毒检测都为阴性（图3），表明要想获得稳定的‘增城蜜菊’脱毒苗，切取0.5 mm的茎尖诱导成苗的脱毒效果好，且稳定。

图2 ‘增城蜜菊’母株的病毒检测

3 讨论与结论

目前，国内外报道能侵染菊花的病毒多达20多种，病毒特点不同，脱除的难易程度也不同［4-5]。在这些侵染菊花的病毒中CVB和TAV病毒对菊花侵染高、危害严重。如VERMA等［11]利用DAS-ELISA对生长在印度喜马偕尔省的菊花进行CVB病毒检测，发现其侵染率最高可以达到94.6%。而MEIJU等［12]对台湾9个地区采集的504菊花样品进行CVB病毒检测，发现CVB病毒感染率高达78%左右。而在福建省的菊花中，TAV病毒侵染率达到了85.9%，造成花朵畸形、褪色、变小，甚至皱缩、扭曲、坏死等，对菊花的生产、销售带来很大威胁［13]。‘增城蜜菊’是通过选育出来的新品种，在林间地、山坡地种植具有较强的优势，能充分利用林地，保护生态环境，同时给林农增加收入。‘增城蜜菊’在栽培过程中表现出了CVB和TAV病毒侵染的表型，影响了产品的产量和质量，通过RT-PCR鉴定，在母株中发现这2种病毒的存在（图2）。利用植物组培技术，获取脱毒苗是保障种苗质量，有利于品种的进一步推广应用。

获得脱毒种苗的方法有茎尖脱毒法、化学处理法、热处理法等。茎尖脱毒利用的是病毒在植物体内分布的不均匀性，在植物生长点或生长点附近无病毒或病毒浓度很低的特点，切取不带毒的生长点培养成苗［14-15]。一般认为，在生产应用中进行脱除病毒时，剥取的茎尖越小，其脱毒效果越好。报道表明，在茎尖为0.1～0.2mm时，脱毒率可达到100%［16]。赵兰勇等［16]做到采用0.3～0.5 mm的茎尖时，脱毒率可达到78.5%～88.5%，这高于本实验的脱毒率（约60%）。但是随着茎尖增大，在茎尖为1.0mm时，该研究表明已经完全脱毒失败［16]。但在本实验中，即使2.0mm的茎尖，也可达到约40%的脱毒率。众所周知，随着剥离茎尖的缩小，成活率就会相应降低，剥取的操作难度也大会幅度增加，与本研究相符合（表1）。因此，本试验结果通过增大茎尖而提高了茎尖脱毒操作及成活率，为菊花的茎尖脱毒提供了重要的参考。

化学药剂用于病毒的脱除，主要是利用了化学物质对植物病毒有体外钝化作用，或者在活体内有抑制病毒及治疗作用，或者可以诱导寄主植物产生与病毒相关的蛋白，从而提高植株的抗病性［17]。化学药剂在实际应用中不同植物会有不同程度的药害，需要做前期的摸索，弄清化学药剂的使浓度和处理时间，如比较广泛应用的病毒唑在使用时就要小心［18]。药剂处理操作简单，脱毒效率较高，但是处理时间比较长，不同的病毒种类对不同种类的药剂反应不同。热处理法脱毒是利用病毒和寄主植物对高温忍耐性的不一样，将带病毒的植物组织处于高于正常温度的适当高温环境，寄主植物组织很少或不会受到伤害，而这种温度可部分或完全钝化植物组织中的病毒，从而达到去除病毒的目的［19-20]。

热处理只对那些球状的病毒或线状的病毒有效果，而对杆状病毒不起作用［21]，对于一些耐热的病毒，这种方法也不适合。这些脱毒方法在菊花脱毒苗的获得中都有研究者用，由于每个方法各有优缺点，也有研究者将其中两种方法结合起来应用［22-24]。赵霜等［22]比较了不同方法脱除“墨菊”体内CVB、黄瓜花叶病毒（C M V）及烟草花叶病毒（T M V）的效果，结果表明直接剥茎尖操作简单，但脱毒效果不强；病毒唑结合茎尖培养法，其脱毒效果虽较前者强，但对植物存在一定的药害作用；热处理结合茎尖培养法的脱毒效果最强，但是热处理持续的时间较长且需要一定的仪器设备，繁殖一批脱毒苗的周期相对较长。在几个处理中热处理结合茎尖培养法的效果最好，但这种方法对不同病毒的脱毒效果有差异，生产上要根据病毒自身的性质选择适宜的脱毒方法。

本研究中以组培苗为材料，直接切取无菌的茎尖作为外植体进行脱毒，结果表明污染少，成苗率高。在JH7的培养基中，即使茎尖切取到0.5 mm时，诱导率仍能达到52.67%，脱毒率为100%（表1，图3），能大大满足生产的需要。赵兰勇等［16]切取0.3～0.5 mm的茎尖时，脱毒率达到78.5%～88.5%，低于本实验。同时，这样也避免了使用2种方法结合起来，才能达脱毒的繁琐。因此，在实践中，需要进一步研究不同品种最佳脱毒效果的相关条件和在生产中采用受市场青睐又容易脱毒的优良品种。

茎尖的诱导成功是茎尖脱毒成功的关键步骤。本研究还分析了椰子汁对‘增城蜜菊’茎尖的诱导的促进作用。由于椰子汁等天然有机物汁液含有氨基酸、植物激素、酶、微量元素等物质而营养丰富，在培养基内加入这些天然有机物能够增强培养物的增殖与分化效应，促进培养物更快更好地生长发育［25]。胡燕梅等［26]研究发现，椰子汁等5种天然有机物的添加有利于大花蕙兰类原球茎的增殖与分化。而在贡菊的培养基中加入椰子汁可以显著的促进贡菊组培苗的壮苗生长［27]。甜叶菊组培时，在培养基中添加椰子汁能促进试管苗的增殖［28]。本研究中，在茎尖诱导培养基中添加椰子汁，对不同长短茎尖的诱导都有促进作用（表1），进一步证明了椰子汁对组织培养的增殖和分化作用。但是由于生产天然有机物的成分及本身的浓度具有不稳定性，受到来源植物产地、品种、季节、株龄、气候、栽培条件等多种因素的影响，以致其有利于培养物生长和分化的成分不稳定，在具体使用时需要做前期的探索研究。

本研究采用的脱毒路径是先用带毒材料建立起无菌繁殖体系后，再用建立起的无菌繁殖体系的顶芽切取微茎尖体进行脱毒，虽增加了脱毒的操作工序，但这条路径比传统的外植体消毒后直接剥离微茎尖的路径，显示脱毒切取的茎尖可以更长，技术难度更低，而成功率比较高。我们的实验研究表明，切取2.0mm的茎尖，也可达到大约40%脱毒率（表1），而赵兰勇等［16]在切取茎尖为1.0mm及以上时的脱毒已失败了。因此，本实验采用的微茎尖脱毒技术操作方法具有一定的生产实践意义。