白条鸡制品生产、贮藏、销售环节中沙门氏菌的分离与鉴定

郭耀东 张英华 韩笑

摘要：通过对陕西省主要白条鸡生产企业加工、贮藏、运输和销售等环节中108份样品进行分析，初步探究陕西省白条鸡制品中沙门氏菌（Salmonella）的分布状况。结果表明，在肉鸡生产各环节采集的样本中未分离得到沙门氏菌;在销售环节样品中有18.75%的样本存在沙门氏菌污染，表明陕西省肉鸡制品生产环节中沙门氏菌控制措施较为完善，风险相对较小，但销售环节中存在交叉污染。

关键词：白条鸡;沙门氏菌（Salmonella）;分离;鉴定;陕西省

中图分类号：TS201.6         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）16-0115-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.026           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： Through the analysis of 108 samples in the processing， storage， transportation and sales of the main white striped chicken production enterprises in Shaanxi province， the distribution of Salmonella in the white striped chicken products in Shaanxi province was explored. Results showed that Salmonella was not isolated in the samples from processing， storage and transportation stages， but isolated in 18.75% samples from the sales stage. It indicated that the sales stage could be contaminated with Salmonella by cross contamination to a certain extent.

Key words： chicken product; Salmonella; isolate; identify; Shaanxi province

沙门氏菌（Salmonella）是一类存在于家禽、鼠类、人类的肠道及粪便中，具有高致病性和中毒性的食源性致病菌。沙门氏菌在食品中主要以家禽（畜）、禽（畜）肉及其肉制品和蛋为传播基质，在鸡肉制品中最为常见[1]。随着中国经济的快速发展，鸡肉制品已成为中国居民消费的主要肉制品之一。肉鸡（白条鸡）养殖加工业已成为陕西省部分地区实施精准扶贫战略的重要产业支柱。但其在生产、贮藏、运输、销售等过程中有较多的不可控因素，特别是沙门氏菌污染水平对产品的质量安全和消费者健康具有重要影响。

本研究对陕西省主要白条鸡加工企业的生产、贮藏、运输和终端销售产业链各环节样品进行采样分析，按照美国农业部和美国食品药品监督管理局推荐的方法指南，利用选择性培养基进行沙门氏菌分离培养，并基于PCR进行初步鉴定，探究沙门氏菌在陕西省主要白条鸡鸡肉制品加工企业及产品终端销售环节的分布状况，以期为下一步进行鸡肉制品沙门氏菌的风险评估、预警和有效控制提供数据支持。

1  材料与方法

1.1  试验材料

1.1.1  主要仪器  MDF-3286S型-80 ℃超低温冰箱，日本三洋公司;GMP-9080型隔水式恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司;5415D型高速离心机、移液器，Eppendorf公司;LAC-5080S型高压灭菌锅，上海民仪电子有限公司;Milli-Q超纯水机，MILLIPORE公司;XS204型百分之一天平，梅特勒公司;Mycircle PCR仪、GELDOCX型凝胶成像系统、Mini-sub Cell电泳仪，Bio-RAD公司;QL-86型漩涡振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司。

1.1.2  試剂  蛋白胨缓冲液（BPW）、四硫磺酸盐煌绿增菌液（TT）、氯化镁孔雀绿肉汤增菌液（RV）、Luria-Bertani（LB）琼脂和Luria-Bertani（LB）肉汤购自北京陆桥技术有限责任公司;XLT4培养基购自美国DIFCO公司;Premix购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.3  标准菌株  LT2沙门氏菌标准菌株，由西北农林科技大学食品科学与工程学院杨保伟副教授提供。

1.2  试验方法

1.2.1  样品采集  2018年1—6月在陕西省主要肉鸡生产企业饲养、生产、贮藏各环节关键工序及位于西安市区的终端产品销售环节采集样品108份。其中，生产环节采样82份、贮藏环节（冷库）采样6份、运输和销售环节采样20份（其中运输环节4份、销售环节16份）。所有样品采集过程均严格按操作规范进行，样品采集后在6 h内4 ℃运回实验室保存。

1.2.2  样品中沙门氏菌分离  根据美国农业部USDA和食品药品监督管理局FDA的方法对所采集的样品进行初步分离[2]。

1）前增菌。全鸡样品用400 mL无菌BPW充分振荡、洗涤;水样取25 mL加入225 mL无菌BPW混合;涂抹样涮到装有20 mL BPW的无菌离心管中;含菌洗液置37 ℃、100 r/min条件下预培养6 h。

2）选择性增菌。将10 mL和1 mL增菌液分别转入100 mL灭菌的TT和RV肉汤中于42 ℃振荡培养24 h。

3）分离培养。分别取适量TT和RV增菌液接种到XLT4培养基上并于37 ℃培养20～24 h。

4）纯化培养。从XLT4培养基上挑取菌落中心为黑色、周边为无色透明环的典型菌落1～2个，接种于XLT4平板纯化，37 ℃培养20～24 h后，挑选单个菌落划线接种到LB培养基，（37±1） ℃培养20～24 h。

1.2.3  PCR鉴定

1）沙门氏菌DNA模版制备。用无菌棉签擦拭适量在LB平板上过夜培养的新鲜疑似沙门氏菌，取180 μL菌悬液于1.5 mL无菌离心管中，100 ℃加热煮沸10 min后，13 200 r/min 离心5～8 min，小心吸取上清液，备用[3]。

2）沙门氏菌PCR鉴定。选用沙门氏菌属特异性引物InvA（F：5′-TATTGTTGATTAATGAGATCCG-3′;R：5′-ATATTACGGAAACACGTT-3′，由西北农林科技大学食品科学与工程学院杨保伟副教授提供）进行确认[4]。PCR反应总体积为25 μL，Premix 12.5 μL，DNA模板5.0 μL，F/R引物各0.3 μL，ddH2O 6.9 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环;72 ℃延伸5 min，在4 ℃保存10 min[5]。

2  结果与分析

2.1  沙门氏菌的分离纯化

对陕西主要肉鸡生产企业生产、贮藏、运输和销售环节各关键工序采集的108份样品进行初步分离纯化。以增菌后在XLT4板上观察得到黑色菌落生长为依据，对其是否受到沙门氏菌污染进行判定。结果表明，在生产、贮藏和运输环节采集的鸡肉及环境样本中均未观察到沙门氏菌菌落形态及颜色特征，但在销售环节中所采集的3份样本中观察到疑似沙门氏菌菌落的形态及颜色特征。

2.2  疑似沙门氏菌菌株PCR鉴定

由图1可知，3株疑似沙门氏菌菌株使用引物InvA扩增后，与沙门氏菌标准模式株Salmonella Typhimurium LT2表现相似，均得到约284 bp的PCR产物。初步判定上述3株疑似沙门氏菌菌株属于沙门氏菌，并计算得到鸡肉销售环节沙门氏菌污染率为18.75%。

3  讨论

在陕西省主要白条鸡生产企业生产、贮藏及运输环节采集的样本中未分离得到沙门氏菌，终端销售环节采集的样本中沙门氏菌污染率为18.75%。污染率相比其他相关研究较低，说明陕西省白条鸡制品产业链中生产环节沙门氏菌控制措施较为完善，风险相对较小[6-10]。但同时销售环节存在交叉污染的可能，在一定程度上可能对消费者健康构成威胁。此外，食品中食源性致病菌污染存在一定程度的季节性变化的特征。根据本研究结果，进一步针对销售环节扩大采样数量和季节，研究分析并准确掌握沙门氏菌在不同季节和产业链各环节的污染特性，并制定有效措施和操作规范，防止沙门氏菌交叉污染，保障鸡肉食品质量安全和消费者健康。

参考文献：

[1] 杨保伟，申进玲，席美丽，等，2007—2008年西安地区鸡肉源沙门氏菌相关特性分析[J].食品科学，2011，32（9）：130-135.

[2] CUI S H，JIE Z，MENG J H. An improved method for rapid isolation of Salmonella against proteus in chicken carcasses[J].Journal of food safety，2006，26（1）：49-61.

[3] 王  丹.雞源性多重耐药沙门氏菌转座子与耐药相关性分析[D].哈尔滨：东北农林大学，2013.

[4] 石  颖，杨保伟，师俊玲，等.陕西关中畜禽肉及凉拌菜中沙门氏菌污染分析[J].西北农业学报，2011，20（7）：22-27.

[5] 陈  璐.熊果酸对肝星状细胞Hedgehog信号通路的影响[D].南昌：南昌大学医学院，2012.

[6] 赖海梅.肉鸡屠宰生产链沙门氏菌的污染情况、耐药性、耐药基因及PFGE分型研究[D].四川雅安：四川农业大学，2015.

[7] 王  瑾.非预增菌实时荧光环介导等温扩增快速检测鸡肉中沙门氏菌的研究[D].南昌：江西农业大学，2017.

[8] 游勇来.沙门氏菌的分离鉴定及PCR快速分型的研究[D].广州：华南理工大学，2013.

[9] 郝宏姗.八省市鸡肉源沙门氏菌污染状况调查及其特性研究[D].陕西杨凌：西北农林科技大学，2012.

[10] 尹明远.新疆乌鲁木齐地区食源性沙门氏菌的检测及特性研究[D].乌鲁木齐：新疆农业大学，2015.