碱热处理结合生物化修饰促进钛表面快速内皮化的研究

吴兴达 曾 琳 吕群松*

（1 广东医科大学信息工程学院，广东 东莞 523808；2 广东医科大学药学院，广东 东莞 523808）

经皮冠状动脉血管支架植入是目前治疗冠心病的一种重要手段，临床上广泛使用的药物洗脱支架会抑制血管内皮细胞增殖，导致血管内皮细胞层修复延迟，容易发生支架植入后再狭窄的风险[1]。支架表面的快速内皮化可减少血小板的激活及血栓形成，形成生物相容性良好的界面，降低远期血栓的风险。本文比较HUVECs在三种不同钛表面的活性和增殖行为，探讨促进支架材料表面快速内皮化的方法。

1 材料与方法

1.1 载槲皮素壳聚糖纳米粒的制备：采用离子交联法，首先配置2 mg/mL的壳聚糖醋酸溶液，磁力搅拌下逐滴滴入槲皮素的乙醇溶液，使槲皮素与壳聚糖的质量比为1∶20，再逐滴滴入三聚磷酸钠溶液，连续搅拌得到淡黄色的胶体溶液。使用Microtrac粒度分析仪分析纳米粒大小及Zeta电位。

1.2 三种钛表面的制备及表征：依次用800、1200、1500、2000目砂纸及抛光布将商业钛片抛光至镜面状态，再分别用丙酮、无水乙醇和蒸馏水超声清洗，获得光滑表面钛片。将光滑钛片在80 ℃的5 mol/L NaOH溶液中浸泡24 h，再置于80 ℃的蒸馏水中浸泡12 h，最后蒸馏水超声清洗，获碱热处理钛片。碱热处理钛片浸泡在载槲皮素壳聚糖胶体中，10 h后取出，用蒸馏水漂洗去表层未吸附的纳米粒，获得生物化修饰钛片。三种钛片干燥喷金后用扫描电子显微镜观察表面形貌。

1.3 HUVECs的培养：HUVECs（购于中国科学院细胞库）培养于含5%胎牛血清，1%内皮细胞生长因子（ECGS）和1%青霉素/链霉素的ECM培养液中。采用培养瓶常规培养，以0.25%的胰蛋白酶消化传代。

1.4 HUVECs活性及增殖能力检测：三种钛片置于12孔板内，HUVECs按2×104cells/孔接种于钛片上，分别孵育24 h和48 h。吸取培养液，加入Calcein-AM （Invitrogen）和碘化丙啶（PI, Sigma-Aldrich）混合液1 mL/孔浸泡样品，37 ℃避光孵育20 min后，用PBS洗去多余染料。4%多聚甲醛固定，荧光显微镜观察、拍照。

2 结 果

2.1 载槲皮素壳聚糖溶液的检测：红色激光笔照射载槲皮素壳聚糖溶液可见明显的丁达尔效应，粒径分析表明绝大部分纳米粒粒径介于100～300 nm，Zeta电位为50.4 mV。见图1。图1显示，红色光束穿过壳聚糖溶液，未见丁达尔效应，表明壳聚糖的醋酸溶液是真溶液；红色光束穿过槲皮素/壳聚糖溶液，侧面可见溶液内部可见光束“通路”，丁达尔效应显著，表明该溶液是胶体；槲皮素难溶于水，经搅拌，其在水中形成浑浊液，光束无法穿透。

2.2 扫描电镜观察钛片结果：抛光后的钛片表面平整，碱热处理后的钛片表面均匀分布大量亚微米量级大小的孔洞，吸附载槲皮素壳聚糖纳米粒后孔洞结构被覆盖，显得相对平滑。见图2、3。

2.3 细胞活性和增殖情况：荧光显微镜观察表明三种钛片表面均未见红色的死亡细胞，所有细胞均呈绿色，表明三种钛片都具有良好的细胞相容性。细胞增殖方面，孵育24 h后，光滑钛片表面细胞较少，碱热处理钛片表面细胞稍多，而生物化修饰钛片的细胞明显多于光滑钛片细胞；孵育48 h后，三种钛片表面细胞密度差异明显增大，尤其是生物化修饰钛片表面的细胞远远多于光滑表面的细胞（图4）。

3 讨 论

钛及其合金密度小、机械性能好、化学性能稳定，是一种广泛使用的生物材料，然而并不适用于与血液直接接触的应用场景[2]。在人工血管、血管支架等血液接触材料的设计中，抗凝血和内皮化是必须解决的两大问题，其中实现材料表面的快速内皮化可降低血栓发生率。壳聚糖是天然多糖甲壳素脱乙酰化而得到的一种碱性氨基多糖，其结构与细胞外基质中的糖胺多糖相似，因此具有极为优良的生物相容性和生物学活性，被广泛应用于生物医学领域[3]。槲皮素是一种常见的黄酮类化合物，广泛存在于植物中，是多种中药的主要成分，能抑制过氧化氢（金属表面在体液内被腐蚀的产物）对内皮细胞的损伤[4]。

图1 激光笔照射三种液体的检测结果

图2 槲皮素-壳聚糖纳米粒的粒径分布

图3 扫描电镜观察钛片结果

图4 细胞在三种钛片表面分别孵育结果

本文通过碱热处理在钛表面腐蚀出大量均匀分布的亚微米级孔洞，细胞增殖实验表明粗糙表面比光滑表面更有利于内皮细胞增殖，这与成骨细胞的情况类似[5]。同时碱热处理增加了钛表面的羟基数量，使表面带负电荷，这是静电吸附载槲皮素壳聚糖纳米粒的基础。而大量亚微米级孔洞也增大了钛材吸附壳聚糖纳米粒的面积，因而增加了载药量。实验结果表明，表面粗糙结构及生物化修饰均有利于内皮细胞增殖，而二者相结合，可极大地促进材料表面的快速内皮化。因此本研究为降低支架内再狭窄率，优化血管支架的远期疗效提供了方法上的参考。