黔产青钱柳中总三萜类化合物的含量测定方法优化及其产地加工研究

王维　叶世芸　殷少文　郑立肯

摘要 [目的]測定黔产青钱柳在不同炮制温度及不同生长年限下总三萜含量的变化，以确定青钱柳产地加工的最佳温度和生长年限对其品质影响的差异。[方法]通过正交试验，样品用30倍量的70%乙醇，超声提取40 min，显色后，在546.5 nm的波长下测定其吸光度。以齐墩果酸为标准品，测定其总三萜的含量。[结果]齐墩果酸浓度在0.004 1～0.024 6 mg/mL与吸光度呈良好的线性关系（r=0.999 7），平均加样回收率为99.55%，RSD为2.24%（n=6），该方法可靠。不同干燥温度和生长年限对黔产青钱柳中总三萜含量的影响具有显著差异，干燥温度在80 ℃时，总三萜的含量高于其他炮制温度下的，并且高温和低温条件下，青钱柳的色泽加深，影响到成品的外观性状。[结论]青钱柳的最佳干燥温度为80 ℃，由于不同生长年限中总三萜含量的差异无规律可寻，有待进一步研究确定。

关键词 青钱柳;干燥温度;生长年限;总三萜;紫外分光光度法;产地加工

中图分类号 R284文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2019）16-0205-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.058

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Optimization of Content Determination of Total Triterpenoids in the Cyclocarya paliurus （Batal.） Iljinskaja of Guizhou and Its Origin Processing Research

WANG Wei1，YE Shi yun1，YIN Shao wen2 et al （1.Guizhou University of Traditional Chinese Medicine，Guiyang，Guizhou 550000; 2.Guiyang Third People′s Hospital，Guiyang，Guizhou 550000）

Abstract [Objective]The research aimed to determine the change of total triterpenoid content in different processing temperatures and different growth period of Cyclocarya paliurus， and to determine the difference in the optimum temperature and growth period of the origin processing of Cyclocarya paliurus.[Method]By orthogonal experiment，the sample was extracted with 70% ethanol of 30 times，ultrasonic extraction of  40 min， and then the absorbance was determined at the wavelength of 546.5 nm.The oleanolic acid was used as a standard to determine the total triterpenoid content.[Result]The content of the oleanolic acid showed a better linear relationship with the absorbance in the range of  0.004 1-0.024 6 mg/mL（r=0.999 7）.The average recovery was 99.55%，RSD was 2.24%（n=6）.The method was reliable.Different drying temperature and growth period of triterpenoid content in Cyclocarya paliurus had significant difference，when the influence of drying temperature was 80 ℃，the content of total triterpenes was higher than other processing temperature，the colour and lustre of Cyclocarya paliurus deepen at high and low temperature conditions，the impact to the finished product appearance.[Conclusion]The best drying temperature of Cyclocarya paliurus was 80 ℃.Because the difference of total triterpenoid content in different growth years is irregular，it needs further research and determination.

Key words Cyclocarya paliurus （Batal.） Iljinskaja;Drying temperature;Growing years;Total triterpenoids;UV-spectrophotometry;Origin processing

青钱柳（Cyclocarya paliurus（Batal） Iljinskaja）是我国特有的单种属高大速生乔木，系胡桃科青钱柳属，在我国各地广泛分布，在贵州省黔东南苗族自治州有大量的野生资源[1-2]，这为当地的青钱柳种质的研究和种植提供了丰富的资源。在政府的大力支持下，已建立了33.3 hm2的种苗培育基地。青钱柳具有显著地降低血糖[3-7]、调节血脂[8-9]、降血压[10-12]的作用而备受医生学者关注。

近些年，有大量的文献报道青钱柳具有抗氧化[13-14]、抗肿瘤、提高免疫力[15]的生物活性，青钱柳中的三萜类化合物具有抗菌[16]、减轻β胰岛细胞的损伤和抑制凋亡[17]、调节酪氨酸蛋白的磷酸化平衡[18]，促进小鼠胚胎成纤维脂肪细胞对葡萄糖的消耗等作用[19]，三萜类化合物是青钱柳的有效物质基础之一，包括熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、科罗素酸和白桦脂酸等。熊果酸和齐墩果酸对三酰甘油和胆固醇的吸收、合成和代谢都有调控作用，通过过氧化物酶体增殖物促进受体的激活、（PPAR）-α表达和拟胰岛素样作用以及调控脂肪细胞PPAR-γ表达和分化，以控制脂质合成、代谢和转运的各种关键酶基因的表达，从而对抗白色脂肪形成和脂肪细胞激素的炎症反应，促进棕色脂肪骨骼肌和棕色脂肪生长、增加机体能量消耗。熊果酸、齐墩果酸能穩定葡萄糖、脂质和能量在体内平衡，其是选择性G蛋白偶联胆汁酸受体TGR5激动剂[20]。山楂酸可显著抑制肺癌细胞的增殖及迁移，并抑制由肺癌细胞诱导的破骨细胞分化，这种抑制作用可能是抑制NF-κb通路和激活线粒体凋亡通路所实现[21-22]。科罗索酸对CaSki宫颈癌上皮细胞的抑制增殖和促凋亡的作用是调节PI3K/Akt信号通路得以实现。白桦脂酸在一定的浓度范围内能够增强自然杀伤细胞（NK细胞）对SW1990胰腺癌细胞有杀伤作用，其可能通过促进NK细胞增殖，抑制胰腺癌细胞的增殖，能激活NK调节蛋白激酶ERK信号通路，提高NK细胞颗粒酶B、穿孔素、γ-干扰素和CD107a的表达[23]。

笔者以青钱柳中总三萜化合物的含量为指标，通过正交试验设计法来优化总三萜含量的测定方法及确定不同生长年限和干燥温度对黔产青钱柳品质的影响[24]，为当地青钱柳的产地加工以及青钱柳类茶剂、酒剂产品的等级划分提供依据和理论支撑，也为以青钱柳为原料的保健食品、特医食品的开发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试剂。

齐墩果酸对照品（上海金穗生物科技有限公司，批号20160511）;无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司，批号60160401）;高氯酸（川东化工，批号20130603）;冰醋酸（柳州市登榜贸易有限公司，批号20151011）;乙酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司，批号20150305）;石油醚（国药集团化学试剂有限公司，批号20160718）;香草醛（上海谱振生物有限公司，批号20150305）。

1.1.2 样品。青钱柳采收于贵州省雷山县，经贵州中医药大学叶世芸教授鉴定为青钱柳（Cyclocarya paliurus）。将叶片去除杂质，分别采用25（室温阴干）、60、70、80、90、100 ℃恒温干燥箱干燥，粉碎，密封保存备用。

1.1.3 仪器与设备。

紫外光谱仪（日本岛津，型号UV2501PC）;电子天平（瑞士梅特勒公司，型号XS205）;分析天平（上海梅特勒，型号AB204-S）;数显恒温水浴锅（金坛市晶玻实验仪器厂，型号HH-4）;电热鼓风干燥箱（天津天泰仪器有限公司，型号101-1A）;超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，型号KQ-100E）。

1.2 试验方法

1.2.1 齐墩果酸对照品溶液的配制。

取齐墩果酸对照品适量，精密称定，置于100 mL容量瓶中，用乙酸乙酯溶液进行定容，摇匀，浓度为0.205 0 mg/mL，备用。

1.2.2 供试品溶液的制备方法。

取青钱柳样品约0.5 g，精密称定，置于索氏提取器中，加入石油醚，在70 ℃水浴中脱脂 3 h，脱脂完成后，将滤渣自然风干后置于圆底烧瓶中，精密加入30 mL的70%乙醇溶液，称定重量后，置超声波清洗器中超声提取40 min后取出，用70%乙醇补足重量，过滤，取续滤液即得青钱柳样品溶液。

1.2.3 显色方法。精密量取供试品溶液 0.2 mL，置于10 mL试管中，水浴蒸干，用移液管吸取5%香草醛-冰醋酸溶液 0.2 mL 和高氯酸溶液0.8 mL加入试管中，摇匀，在60 ℃水浴中加热15 min，取出，迅速冷却后加入4 mL冰醋酸，并用70%的乙醇定容至10 mL，摇匀，即得。

2 结果与分析

2.1 检测波长

精密量取一定量的齐墩果酸对照品溶液及

供试品溶液，按“1.2.3”方法显色，用紫外光谱仪在200～ 800 nm 波长扫描[25]，确定最大吸收波长为546.5 nm（图1）。

2.2 标准曲线的绘制

精密吸取齐墩果酸对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于试管中水浴挥干，同时进行显色处理，在546.5 nm处测定其吸光度。结果发现，齐墩果酸对照品溶液的浓度在0.004 1～0.024 6 mg/mL与吸光度呈良好的线性关系，回归方程为y=52.864x-0.092 3（r=0.999 7）。

2.3 样品处理条件的优化

取脱脂后的青钱柳粉适量，精密称定，将滤渣自然风干后置于圆底烧瓶中，按通过单因素考察的水平，以表1的条件处理样品，结果见表2。

经方差分析，发现乙醇浓度对含量测定结果有显著影响（F=5.148，P=0.043<0.05），通过极差和因素指标分析，确定最佳的料液比和超声时间并经验证，最终得出最佳的提取条件为：料液比为1∶30，70%乙醇溶液，超声提取40 min。

2.4 稳定性试验

精密称取样品适量，按“1.2.2”方法处理样品，按“1.2.3”方法进行显色，分别于0、5、10、15、20、25 min连续测定6次，结果发现吸光度的RSD为0.30%（n=6），表明样品在25 min内稳定。

2.5 精密度试验

精密量取“1.2.1”项下对照品适量，按 “1.2.3”方法显色，测定吸光度，结果发现吸光度的RSD为 0.27%，表明仪器的精密度良好。

2.6 重复性试验

取6份青钱柳，精密称定，分别按“1.2.2”方法處理样品，按“1.2.3”方法进行显色，测定吸光度，结果见表3，吸光度的RSD为2.47%，表明该试验方法重现性良好。

2.7 加样回收试验

取已知总三萜含量的药材6份，精密称定，加入与已知药材中总三萜相当量的齐墩果酸，再按 “1.2.2”方法处理，按“1.2.3”方法进行显色，测定吸光度，结果发现（表4），平均回收率为99.55%，RSD为2.24%，表明该试验方法可靠。

2.8 样品的测定 将不同生长年限、不同干燥温度下的60份青钱柳，按“1.2.2”方法处理，按“1.2.3”方法进行显色，测定吸光度并计算总三萜含量，结果发现（表5），不同干燥温

度和生长年限对黔产青钱柳中总三萜含量的影响具有显著性差异，干燥温度在80℃时，总三萜的含量高于其他炮制温度下的。

通过方差分析，干燥温度F=8.875、P=0.00<0.05，生长年限F=12.841、P=0.000<0.05，所以干燥温度和生长年限对青钱柳中总三萜的含量有显著影响。 对60份样品进行统计分析，低温和高温会使青钱柳中的总三萜含量变低，而最佳的干燥温度为80 ℃，结果见图2。分别对干燥温度和生长年限总三萜含量的均值进行聚类分析，阴干和100 ℃，60、70和90 ℃，80 ℃聚为3类，而生长年限对总三萜含量的影响无规律可寻，结果见图3。但从加工过程可以观察到，样品的生长年限越长，叶片硬度越大，会造成叶片碎裂，难以成型，最佳的是3～7年生的青钱柳。

3 结论与讨论

该研究测定黔产青钱柳在不同炮制温度及不同生长年限下总三萜含量的变化，以确定青钱柳产地加工的最佳温度和生长年限对其品质影响的差异。通过正交试验，确定样品用30倍量的70%乙醇，超声提取40min，显色后，在546.5 nm的波长下测定其吸光度。以齐墩果酸为标准品，测定60批青钱柳样品总三萜的含量，结果发现，不同干燥温度和生长年限对黔产青钱柳中总三萜含量的影响具有显著差异，干燥温度在80℃时，总三萜的含量高于其他炮制温度下的，并且高温和低温条件下，青钱柳的色泽加深，影响到成品的外观性状。青钱柳的最佳干燥温度为80℃，由于不同生长年限中总三萜含量的差异无规律可寻，有待进一步研究确定。

黔产青钱柳野生资源丰富，历史悠久，民间多以青钱柳茶饮，以初春嫩叶为原料，经过炒制而成[26]。茶饮气清香、味甘甜、色泽呈红棕色，具有生津止渴、清热解暑的功效，特别适宜于现代三高类慢性疾病人群的饮用[27-28]。随着贵州省青钱柳种植面积的扩大，青钱柳的采摘和产地加工亟待解决，吴琳琳等[29]采用中药指纹图谱的方法，对青钱柳的10个采收期进行研究，确定的最佳采收期在8月末和9月初。通过对当地青钱柳种植基地的调研，当地农民仅凭借经验，青钱柳在清明节前后采摘，原因是这个季节采摘的叶片破碎率低、干燥率高、容易加工。用传统炒茶机加工青钱柳，对原料的含水量和硬度要求较高，经过筛选后加工会造成青钱柳资源的浪费，而且加工温度不易控制，会影响产品质量。该研究以总三萜的含量为指标，对不同生长年限的青钱柳在不同干燥温度下加工，并考察其对成品性状的影响，以解决青钱柳的产地加工问题。

贵州省建立了青钱柳种植基地，随着青钱柳面积种植的扩大化，青钱柳的规范化种植、产地加工等技术亟待解决。青钱柳的产地炮制温度就是其影响品质的关键技术之一，该研究结果可以作为青钱柳产地加工的技术支撑，也为以后加工设备参数的设定提供理论依据。青钱柳于冰川世纪保存至今，是国家重点保护的濒危植物之一[30] ，但在对贵州省青钱柳种植基地进行资源考察时发现，由于加工设备的落后，导致生长年限较久的叶子无法加工，造成大量的稀缺资源的浪费。该研究也对不同生长年限的青钱柳的质量进行了初步探讨，结果无规律可寻，所以有待进一步研究。

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