响应面法优化提取云南苦荞黄酮工艺研究
2019-09-19蒋高华蔡冰彭兴华余家友陈业高
蒋高华 蔡冰 彭兴华 余家友 陈业高
摘要 [目的]建立優化苦荞黄酮的乙醇回流提取工艺。[方法]在单因素试验的基础上，采用响应面分析法对影响苦荞中总黄酮提取率的4个主要因素乙醇体积分数、液料比、提取时间、提取温度进行研究。[结果]以Box-Behnken 中心组合设计建立数学模型，探索最佳试验提取条件为乙醇体积分数45%、提取温度80 ℃、时间 2.0 h、液料比 40∶1（mL∶g），在该条件下实际总黄酮含量为0.059 0 mg/g，提取率为2.9 %。[结论]该研究结果与回归模型的预测值（0.059 2 mg/g）基本相符。
关键词 苦荞;黄酮;响应面法
中图分类号 R284.2文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）16-0191-05
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.16.055
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Study on Optimal Extraction of Flavonoids from Tartary Buckwheat in Yunnan Province by Response Surface Methodology
JIANG Gao hua1，2，3，CAI Bing2，PENG Xing hua2 et al （1.Key Laboratory of Plant Resources and Chemistry，The Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry，CAS，Urumqi，Xinjiang 830011;2.College of Resources and Environmental Engineering，Yunnan Vocational Institute of Energy Technology，Qujing，Yunnan 655001;3.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100190）
Abstract [Objective]This paper established the optimization of buckwheat ethanol reflux extraction technology of flavonoids.[Method]On the basis of single factor experiment，using response surface method to analyze four main factors influencing flavone extraction yield from tartary buckwheat：ethanol volume fraction，liquid solid ratio，extraction time，extraction temperature.[Result]With Box Behnken central composite design to establish mathematical model，the optimum extraction conditions were：ethanol 45%，temperature 80℃，time 2.0 h，liquid solid ratio 40∶1 （mL∶g），under this condition flavonoids content was 0.059 0 mg/g，extraction rate was 2.9%.[Conclusion]The result is basically consistent with the predicted value （0.059 2 mg/g） of the regression model.
Key words Tartary buckwheat;Flavone;Response surface methodology
苦荞属双子叶蓼科荞麦属植物，耐寒、耐旱、耐酸、耐贫瘠，生长周期短，在我国西南、北方种植广泛，资源丰富[1]。《本草纲目》记载：苦荞麦味苦、平、寒，有益气力、续精神、利耳目、隆气宽肠健胃的作用。苦荞中含有极为丰富的总黄酮类物质，是植物经光合作用产生的，主要是芦丁、槲皮素等[2]。研究发现，总黄酮类化合物具有降血糖、降血脂、防癌、抗突变、增强免疫力、杀菌、抗动脉粥样硬化、抗衰老等功能。苦荞在医药、化妆品、保健品方面有广阔的应用前景，民间亦以食用苦荞防治糖尿病、高血压、高血脂等病[3]。苦荞中富含总黄酮，可作为总黄酮的重要材料来源[4]。目前国内对苦荞壳中总黄酮的提取和研究多使用正交试验法[5]。而采用响应面法优化提取工艺的研究报道不多[6-7]。
笔者采用响应面法对苦荞壳中总黄酮的提取方法和提取工艺进行优化，确定最佳提取条件，旨在为工业上大规模生产苦荞总黄酮提供理论依据，对充分、合理开发利用苦荞资源具有重要意义。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料。苦荞麦采自云南省宣威市杨柳乡克基村白草坪，干燥后粉碎，备用。
1.1.2 仪器和试剂。TU-1901双光束紫外可见分光光度计;超声波清洗器;电子分析天平;电热数显恒温水浴锅;全自动鼓风干燥箱。
芦丁标准品（UV98%，上海金穗生物科技开发有限公司;无水乙醇（AR.，国药试剂）;亚硝酸钠（AR.，国药试剂）;硝酸铝（AR.，国药试剂）;氢氧化钠（AR.，国药试剂）。
1.2 方法
1.2.1 芦丁标准曲线的绘制。
准确称取120 ℃烘干至恒重的芦丁标准品20 mg，用70%乙醇溶解，定容至100 mL，得浓度为0.2 mg/mL芦丁标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0、3.0、6.0 、9.0、12.0 mL于50 mL棕色容量瓶中，加入5%NaNO 2溶液 1.5 mL，摇匀，放置6 min后加入10%Al（NO 3） 3溶液 1.5 mL，摇匀，放置6 min后加入4%NaOH溶液20 mL，再用70%乙醇定容，摇匀;以70%乙醇为空白参比，10 min后在波长510 nm处测定吸光度值，得芦丁含量（C，μg/mL）与吸光度（A）回归方程：A=0.006 45×C-0.019，R2=0.998 3，线性关系良好。
1.2.2 黄酮的提取与测定。准确称取试验备用的苦荞2.0 g，按设定好的乙醇体积分数、液料比、提取时间、提取温度进行苦荞的乙醇回流提取，以充分溶解苦荞麦中的黄酮类物质。水浴锅加热回流后，停止加热，常温得浸提液，将每次试验所得浸提液转入量筒中加入70%乙醇定容至刻度，得待测样品溶液。以空白样品为对照，在波长510 nm处测定吸光度。根据标准曲线回归方程A=0.006 45×C-0.019推导样品的黄酮浓度，计算样品的黄酮提取率。
1.2.3 单因素试验。称取多份2.0 g苦荞，在乙醇回流提取情况下，分别对乙醇体积分数、液料比、提取时间、提取温度进行单因素试验，分别考察这4个因素对总黄酮收率的 影响。
1.2.4 响应面试验设计。在单因素试验的基础上，选择影响总黄酮提取率的4 个主要因素（浸提时间、浸提温度、乙醇浓度、液料比），确定好水平范围，做4因素3水平（表1）共30个试验点（6个中心点）的响应面分析试验[8]。
2 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 乙醇体积分数对苦荞中总黄酮提取率的影响。
由图1可以得出，随着乙醇体积分数的增加，苦荞中总黄酮提取率和含量也增加，当乙醇体积分数为40%时，其提取率和总黄酮含量达到最大，提取率为1.817 3%。当乙醇浓度再增加时，其总黄酮提取率和含量下降，可能是由于此时随着乙醇浓度的增大，总黄酮类化合物溶解度减少，同时一些醇溶性物质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加，这些物质同乙醇和水分子的结合，导致总黄酮类化合物的提取率下降，故选取40%乙醇体积分数。
2.1.2 液料比对苦荞中总黄酮提取率的影响。
由图2可知，随着液料比的增大，苦荞中总黄酮提取率和含量逐渐上升;开始液料比为10∶1时，可能是由于浸提溶剂较少而造成;当液料比超过30∶1时，提取率和含量呈缓慢上升趋势;液料比为70∶1时，其提取率和总黄酮含量达到最大，提取率为 3.873 8%。出于节省溶剂的考虑，选取40∶1的液料比。
2.1.3 提取时间对苦荞中总黄酮提取率的影响。
由图3可知，提取时间在0.5～1.0 h，苦荞中总黄酮提取率和含量的变化不是很明显;当提取时间为1.5和2.5 h，达到了比较好的效果;提取时间为1.5 h，提取率为0.739 2%;提取时间为 2.5 h，提取率为1.645 2%。但从提取工艺的时间和周期等角度考虑，试验选择提取时间为2.0 h。
2.1.4 提取温度对苦荞中总黄酮提取率的影响。
由圖4可知，随着提取温度的升高，苦荞中总黄酮提取率和含量升高较快。可能的原因是总黄酮在乙醇中的溶解度随着温度的升高而增大，同时随着温度升高，提取液黏度减小，扩散系数增加，使提取速度加快。但温度过高，一方面使其中的活性成分容易破坏，杂质的溶出量增加，给后续操作带来不便，成本费用增大;另一方面将造成溶剂损失。再则，温度超过80 ℃时，总黄酮提取率下降。综合各个方面的因素，选择提取温度 为80 ℃。
2.2 响应面试验结果
运用 Design-Expert 8.0软件对响应面试验数据（表2）进行方差分析，结果见表3。以苦荞壳中总黄酮的含量（Y）为响应值，经回归拟合后，各试验因子对响应值的影响可用如下多元二次回归方程表示：
Y=0.044+5.508E-003A+0.014B+5.567E-003C+1.692E-003D+2.125E-003AB+7.525E-003AC-0.014AD+ 1.000E-003BC+2.475E-003BD+5.750E-004CD- 5.150E-003A2-7.937E-003B2-0.010C2
该模型的决定系数为0.850 1，表示有85.01%的数据可用该模型解释，说明方程可靠性较高。变异系数值越低，显示试验稳定性越好，该试验中变异系数值较低，为24.12%，说明试验操作可信[9]。由方差分析表3可知，模型的（Prob>F）<0.01（极显著），表明模型充分拟合试验数据，该方程是苦荞中总黄酮含量与提取工艺参数的合适数学模型，能较好地起到预测作用;同时回归方程失拟项检验不显著，说明未知因素对试验结果干扰很少。从表3还可以看出，二次项（C2）的P<0.01，表明苦荞中总黄酮的含量影响达极显著水平;二次项（B2和D2）的0.05
由表3可知，该试验所选模型不同处理间差异较显著，说明回归方程描述各因子与响应值之间的关系时，应变量和自变量之间线性关系显著，试验方法可靠。变异系数较小（CV为24.12%），说明试验稳定性较好。模型相关系数（R2）为0.850 1，说明该模型可靠性较好。从回归方程模拟因变量的方差分析可知，影响苦荞中总黄酮含量的单因素大小排序依次为液料比（B）、提取时间（C）、乙醇体积分数（A）、提取温度（D）。
2.3 苦荞中總黄酮提取的响应面法分析与优化
由图5可见，总黄酮含量与液料比具有明显的二次抛物线关系，在液料比40∶1～42∶1 附近出现峰值。在一定条件下，随着液料比的增加，苦荞中总黄酮的浸出量会明显增加，到达峰值后，会开始下降。
由图6可见，响应面开口向下，随着每个因素的增大，响应值总黄酮含量也增大，当总黄酮含量增大到极值后，随着乙醇体积分数和液料比的增大，总黄酮含量逐渐减小。该模型有稳定点，且稳定点是最大值。
由图7可见，乙醇体积分数一定时，随着提取时间的增加，总黄酮含量发生很小的变化;提取时间一定，总黄酮含量随着乙醇体积分数的升高而逐渐变大，到达峰值后，开始减少。这可能是由于随着乙醇体积分数的升高，使得一些非总黄酮类物质溶出，并和总黄酮类物质竞争乙醇，使得总黄酮类物质溶出量减少。
由图8可见，总黄酮含量与乙醇体积分数也呈明显的二次抛物线关系，在46%～48%附近出现峰值。根据相似相溶原理，苦荞中总黄酮极性与此范围乙醇溶液的极性相当，因此在这一体积分数溶液中溶解性较好。总黄酮含量随温度的升高显著增加，呈直线上升趋势。
由图9可见，总黄酮含量随提取温度的升高呈直线上升趋势，随液料比的增大呈先升高后下降的趋势。在提取温度最高时，总黄酮含量最大。
由图10可见，总黄酮含量随提取时间的延长和温度的提高快速增加，在达到峰值以后，开始快速下降。根据浸提动力学理论，时间的延长有助于总黄酮的充分扩散溶出，同时温度的升高使得分子解附和扩散运动速度加快，从而提高了总黄酮的浸出速率和得率。故适当延长浸提时间和提高温度有助于提高总黄酮的提取率和浸出量。
综上所述，可直观地反映各因素交互作用对总黄酮提取率和总黄酮含量的影响。图中曲线越陡峭，表明该因子对苦荞中总黄酮提取率的影响越大;反之，曲线越平滑，表明该因子对苦荞中总黄酮得率的影响较小[10]。其中提取温度（D）和提取时间（C）、乙醇体积分数（A）和提取温度（D）对总黄酮的提取率的交互影响，表现为曲线较陡;而其他因素的交互影响，曲线表现的较为平滑。根据以上的数据分析表明，苦荞中总黄酮含量的交互影响顺序为AD>CD>BC>AC>AB>BD。
3 结论
通过回归模型预测的苦荞中总黄酮提取的最佳工艺条件为乙醇体积分数47%，提取温度80 ℃，提取时间2 h，料液比42∶1，在该条件下，苦荞中总黄酮含量理论上可 达0.059 2 mg/g。
通过 Design-Expert 8.0软件分析，对二次多项回归方程模型得出的最佳条件进行验证性试验，考虑到实际操作的可行性，将苦荞中总黄酮的提取条件在回归方程得到的理论基础上修正为乙醇体积分数45%，提取温度80 ℃，液料比 40∶1，提取时间2.0 h，采用此工艺条件进行验证试验，实际测得苦荞中总黄酮含量为0.059 0 mg/g，提取率为2.9%。说明采用响应面法得到的工艺参数可靠，具有一定的实际应用 价值。
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