血浆循环miR-328-3p与风湿性心脏病合并心房颤动的关系

唐春仕 卢新林 谭利辉

[摘要]目的 探討血浆循环miR-328-3p是否与风湿性心脏病合并心房颤动的发生有关，并初步探讨其发病机制。方法 选取2017年8月～2018年7月于湖南省郴州市第四人民医院心血管内科住院的19例风湿性心脏病合并心房颤动患者作为观察组，选取同期21例风湿性心脏病窦性心律患者作为对照组。采用qRT-PCR检测其血浆循环miR-328-3p的表达;分析血浆循环miR-328-3p相对表达量的ROC曲线;采用mirFocus和starBase等生物信息学软件对miR-328-3p进行生物信息预测。结果 观察组的血浆循环miR-328-3p mRNA表达水平为0.31±0.05，低于对照组的0.69±0.03，差异有统计学意义（P<0.01）。ROC曲线分析，血浆循环miR-328-3p曲线下面积为0.9323，95%置信区间为0.8598～1.0005（P<0.01）。生物信息学预测显示，miR-328-3p的KEGG信号通路主要有细胞分裂、结合蛋白、心室形成、调控胰岛素受体信号通路、调控PI3K通路、调控Wnt通路等有关，其靶基因主要是TLE1、USP37、EN2、NRIP1、FOXO4等。结论 血浆循环miR-328-3p可能参与风湿性心脏病合并心房颤动的发生，可以作为风湿性心脏病合并心房颤动的生物标志物;其有可能通过调控PI3K通路和Wnt通路而导致风湿性心脏病合并心房颤动的发生。

[关键词]miR-328-3p;风湿性心脏病;心房颤动;生物标志物;信号通路

[中图分类号] R541.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）6（a）-0008-05

[Abstract] Objective To investigate whether plasma circulating microRNA-328-3p is related to the occurrence of rheumatic heart disease with atrial fibrillation， and to explore its pathogenesis. Methods A total of 19 patients with rheumatic heart disease and atrial fibrillation from August 2017 to July 2018 were selected as observation group and 21 patients with sinus rhythm of rheumatic heart disease were selected as control group. The expression of plasma circulating microRNA-328-3p  was detected by qRT-PCR. The ROC curve of the relative expression of plasma circulating microRNA-328-3p was analyzed. Bioinformatics software such as mirFocus and starBase were used to predict the bioinformatics of microRNA-328-3p. Results The expression level of plasma circulating microRNA-328-3p of the observation group was 0.31±0.05， lower than 0.69±0.03 in the control group， the difference was statistically significant （P<0.01）. ROC curve analysis showed that the area under the plasma circulating miR-328-3p curve was 0.9323， 95% confidence interval was 0.8598-1.0005 （P<0.01）. Bioinformatics predictions showed that the KEGG signaling pathways of microRNA-328-3p were mainly related to cell division， binding protein， ventricular formation， insulin receptor signaling pathway， PI3K pathway， Wnt pathway and so on. The target genes are TLE1， STT3A， USP37， EN2， NRIP1， FOXO4 and so on. Conclusion Plasma circulating microRNA-328-3p may be involved in the occurrence of rheumatic heart disease with atrial fibrillation， and can be used as a biomarker of rheumatic heart disease with atrial fibrillation. It may lead to the occurrence of rheumatic heart disease with atrial fibrillation by regulating PI3K pathway and Wnt pathway.

[Key words] MiR-328-3p; Rheumatic heart disease; Atrial fibrillation; Biomarkers; Signaling pathways

心房颤动（Atrial fibrillation）是临床上常见的持续性心律失常，其总体发病率为1%～2%。我国大规模流行病学研究显示，中国成年人患病率为0.77%，男性（0.9%）高于女性（0.7%），并且随年龄增加患病率显著增高，80岁以上人群患病率可达7.5%[1]。一项对全国22家省级医院心内科住院患者的回顾性调查显示，心内科住院患者中心律失常占26.8%，其中房颤所占比例为35.0%[2]。目前关于房颤发生的机制尚不清楚，目前多认为与心房重构、电重构、神经重构有关[3]。房颤的病因多与遗传、高血压、冠心病、心肌病和风湿性心脏病等有关[4]。国内风湿性心脏病合并心房颤动患者仍占较大的比例，而且此类患者脑血管事件发生较多，致残、致死率高，为患者和社会带来严重负担。目前的研究结果显示，miR-1、miR-26、miR-133、miR-590、miR-21、miR-29等都与心房颤动发病有关[3，5]，而关于风湿性心脏病合并心房颤动与miRNA的研究较少。有研究显示，风湿性心脏病合并心房颤动患者心房组织中的miR-328表达上调，约为正常组的3.5倍，并通过靶基因预测及细胞学研究证实miR-328的靶基因是CACNA1C和CACNB1同时可调控L型Ca2+通道的两种亚基蛋白，通过对L型Ca2+流产生影响达到缩短动作电位时程而参与房颤的电重构[6]。对人体心房颤动发病机制进行研究具有一定难度，主要难以获取心脏组织，近期研究显示，循环miRNA在血浆、尿液等稳定存在可作为疾病诊断和治疗的标志物，该方法样本获取较为简单[3，7-9]。本研究旨在探讨血浆循环miRNA-328-3P是否与风湿性心脏病合并心房颤动的发病有关，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2017年8月～2018年7月于湖南省郴州市第四人民医院心血管内科住院的19例风湿性心脏病合并心房颤动患者作为观察组，选取同期21例风湿性心脏病窦性心律患者作为对照组。观察组中，男6例，女13例;平均年龄（67.40±2.48）岁;平均收缩压（127.20±8.21）mmHg;吸烟史4例;平均血糖（6.99±1.40）mmol/L;平均总胆固醇（5.21±0.26）mmol/L;平均三酰甘油（1.28±0.16）mmol/L;平均高密度脂蛋白（1.35±0.08）mmol/L;平均低密度脂蛋白（3.26±0.22）mmol/L。对照组中，男10例，女11例;平均年龄（67.05±2.77）岁;平均收缩压（123.10±8.95）mmHg;吸烟史6例;平均血糖（6.35±0.66）mmol/L，平均总胆固醇（5.24±0.26）mmol/L;平均三酰甘油（1.58±0.17）mmol/L;平均高密度脂蛋白（1.29±0.06）mmol/L;平均低密度脂蛋白（3.17±0.23）mmol/L。两组患者的一般资料比较，差異无统计学意义（P>0.05），具有可比性。所有患者均知情同意;本研究已经湖南省郴州市第四人民医院医学伦理委员会审核批准。纳入标准：明确诊断为风湿性心脏病（心脏彩超确诊）者;明确诊断患有心房颤动或者窦性心律（心电图确诊）者;年龄45～75岁者。排除标准：严重肝肾功能不全、恶性肿瘤者;妊娠或哺乳期妇女。

1.2方法

两组患者于入院24 h内抽取2 ml静脉血，并分离血浆（3000 r/min，4℃，10 min，eppendorf离心机离心半径10 cm），保存于-80℃冰箱，以备后续试验用，收集患者基本病史和生化检测指标。

首先用Trizol（Invitrogen，美国，批号：15596026）按照说明书提取所获取血浆的总RNA，按照miRNA逆转录试剂盒（Mir-X miRNA First Strand Synthesis Kit，宝生物工程大连有限公司，批号：638315）说明书将所提取总RNA进行逆转录，然后按照实时荧光定量PCR试剂盒（宝生物工程大连有限公司，批号：RR055A）说明书进行扩增：95℃预变性30 s;95℃扩增、延伸15 s;60℃退火30 s，共40个循环，以U6（宝生物工程大连有限公司，批号：CD200-0300）作为内参，上游引物序列：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游引物序列：AACGCTTC ACGAATTTGCGT。miRNA-328-3p（hsa-miR-328-3pqPCR Primer，天根生物科技有限公司，批号：CD201-0349），上游引物序列：GGGGCAAGTCACTAGTGGTT，下游引物为通用引物，序列：5′CAGTGCGTGTCGTGGAGT3′。本研究采用2-ΔΔCt相对定量方法对数据进行分析，将实验所得Ct值代入相对定量公式：ΔΔCt=（待测组目的基因平均Ct值-待测组管家基因平均Ct值）-（对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值），以最终结果2-ΔΔCt，进行统计学分析，以对比目的基因的mRNA水平。

采用生物信息学软件starBase[10-11]（http：//starbase.sysu.edu.cn）预测miR-328-3p的生物学功能、靶基因、基因本体（gene ontology，GO）生物学功能、京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genesand genomes，KEGG）和PANTHER信号通路等，探讨其生物功能和可能致病机制。

1.3观察指标及评价标准

观察并记录两组患者血浆中miR-328-3p的表达水平，并比较两组血浆中miR-328-3p表达的差异，同时，进行标志物曲线分析，采用接受者操作特性（receiver operating characteristic，ROC）曲线进行分析，判断血浆循环miR-328-3p是否可作为风湿性心脏病合并心房颤动的生物标志物，ROC曲线下面积（area under curve，AUC）在>0.5的情况下，AUC越接近1，说明诊断效果越好，AUC在>0.5～0.7时有较低准确性，AUC在>0.7～0.9时有一定准确性，AUC>0.9时有较高准确性，AUC=0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值，AUC<0.5不符合真实情况，在实际中极少出现。

1.4统计学方法

采用Graph Pad Prism 5（Graph Pad Software Inc，CA，USA）进行数据分析，计数资料采用χ2检验或Fisher精确检验;计量资料采用均数±标准差（x±s）表示，采用t检验;标志物曲线采用ROC曲线进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1两组患者血浆循环miR-328-3p mRNA表达的比较

观察组患者的miR-328-3p mRNA表达水平为0.31±0.05，低于对照组的0.69±0.03，差异有统计学意义（P<0.01）（图1）。观察组的miR-328-3p mRNA表达水平为对照组的44.93%。

2.2血浆循环miR-328-3p 相对表达量的ROC曲线分析

血浆miR-328-3p 的AUC为0.9323，95%置信区间为0.8598～1.0005（P<0.01）。血浆循环miR-328-3p 相对表达量的ROC曲线见图2。

2.3 血浆循环miR-328-3p生物信息学分析

预测结果显示，靶基因主要包括TLE1、USP37、EN2、NRIP1、FOXO4、H2AFX、UBFD1、TMEM64、PTPRF、UBE2Z等;miR-328-3p的生物学功能主要参与GO生物过程和分子功能，与心室形成、蛋白结合、细胞分裂等有关;mi-328-3p可能参与调控的KEGG和PANTHER信号通路主要包括：胰岛素受体信号通路、调控PI3K通路、调控Wnt通路（Wnt signaling pathway）等，见表1。

3讨论

近年来，非编码RNA逐渐成为医学研究的热点，尤其以miRNA与疾病相关研究越来越受到重视。关于miRNA与心房颤动发病机制的研究尚处于起步阶段，就目前的研究来看，没有得出较为一致的结论。现有数据只能提示miRNA可能与心房颤动的发生有关，但其具体作用机制尚待研究。由于miRNA对靶基因的调控特性，可能要找到一个真正的靶点还有待深入研究。目前将miRNA作为疾病标志物的研究较为成熟，尤其在肿瘤学和心血管疾病方面[12-14]。关于心血管疾病标志物，目前主要集中在心肌梗死，其miRNA标志物目前已经报道了很多类型，但没有一个真正可以应用于临床疾病诊治的具体标准。

人类发现的miRNA多达上万种，各个miRNA的功能和作用尚未定论。其中miR-328-3P因其在多种疾病基因谱中的差异性表达脱颖而出，特别是在心血管疾病及肿瘤领域受到科研人员的广泛关注。研究显示，miR-328-3P不仅在心血管疾病的临床治疗及预后等方面有重要潜力，其异常表达也与心血管疾病的发生发展密切相关，有作为重要标志物的潜力，在心血管疾病的临床诊断、评估、治疗及预后等方面可能有重要的价值[12，15-16]。关于miR-328-3P与心房颤动的研究目前较多，王璽等[17-19]研究显示，房颤患者血浆miR-328-3P表达显著升高，可能参与了心房解剖重构;从而为其诊治提供新思路。Lu等[6]研究发现，miR-328-3P通过影响L型Ca2+通道基因使心房发生电重构而诱导心房颤动的发生，为其发生提供了一种新型的分子机制，并将miR-328-3P视为心房颤动的潜在治疗靶点。McManus等[20]发现循环miR-328-3P通过减小L型Ca2+通道密度而促进电重构，与心房颤动的发生密切相关，同时提出通过调整促进心房重构的风险因素（高血压），减少miR-328-3P和心房颤动之间的关联，将miR-328-3P作为心房重构和心房颤动易患因素之一。

关于miR-328-3P风湿性心脏病合并心房颤动的研究较少。本研究对循环miR-328-3P-3p与风湿性心脏病合并心房颤动进行了一个初步研究，在较小的样本人群中显示，血浆循环miR-328-3P-3p在风湿性心脏病合并心房颤动人群中高表达，可以作为风湿性心脏病合并心房颤动人群的标志物，其具体机制还有待后续研究和大规模样本进行验证。

随着研究的深入，发现血浆或者血清中循环miRNA可以作为心房颤动发生发展的生物标志物[3，6-7]，如循环miR-150和miR-29等，对于心血管系统疾病而言，活体组织不易获得，因此通过检测循环血中的生物标志物，对病情进行评估一直也是研究的热点，也为心房颤动和miRNA的研究提供了一个新的方向。但将血浆中或者血清中miRNA作为心房颤动标志物的研究相对较少，而且多是单中心、小样本的病例对照研究;且对于血浆、血清miRNA的产生机制、存在形式、生物学功能等尚不清楚，需要进一步深入研究。另外关于其内参的选择可能导致假阳性或者假阴性结果的出现，有研究显示，常见的内参如U6、SNORD48、SNORD44、miR-16和5S等并不一定都可以作为内参，可能对miRNA的检测产生较大影响，经过验证发现SNORD48可能为最佳内参，而U6作为内参的效果最差。因此，很多相同miRNA的研究往往不能重复，可能与内参的选择有关，在进行内参选择时，最好不要选择某一个内参，可以采用不同内参进行比较研究。

[参考文献]

[1]陈伟伟，高润霖，刘力生，等.《中国心血管病报告2017》概要[J].中国循环杂志，2018，33（1）：1-8.

[2]Macle L，Cairns J，Leblanc K，et al.2016 focused update of the canadian cardiovascular society guidelines for the management of atrial fibrillation[J].Can J Cardiol，2016，32（10）：1170-1185.

[3]Tao H，Shi KH，Yang JJ，et al.Epigenetic mechanisms in atrial fibrillation：new insights and future directions[J].Trends Cardiovasc Med，2016，26（4）：306-318.

[4]Fu S，Huang L，Wang Y，et al.MicroRNA as a novel player in atrial fibrillation[J].Front Genet，2014，30（5）：97.

[5]Luo X，Yang B，Nattel S.MicroRNAs and atrial fibrillation： mechanisms and translational potential[J].Nat Rev Cardiol，2015，12（2）：80-90.

[6]Lu Y，Zhang Y，Wang N，et al.MicroRNA-328 contributes to adverse electrical remodeling in atrial fibrillation[J].Circulation，2010，122（23）：2378-2387.

[7]Zhou Q，Maleck C，von Ungern-Sternberg SNI，et al.Circulating microRNA-21 correlates with left atrial low-voltage areas and is associated with procedure outcome in patients undergoing atrial fibrillation ablation[J].Circ Arrhythm Electrophysiol，2018，11（6）：e006242.

[8]Wang J，Liew O，Richards A，et al.Overview of microRNAs in cardiac hypertrophy，fibrosis，and apoptosis[J].Int J Mol Sci，2016，17（5）：749.

[9]Wang Y，Kang W，Wang X，et al.Functional role and mechanism of microRNA-28b in atrial myocyte in a persistent atrial fibrillation rat model[J].Med Sci Monit，2016，22（30）：3073-3078.

[10]Li JH，Liu S，Zhou H，et al.starBase v2.0：decoding miRNA-ceRNA，miRNA-ncRNA and protein-RNA interaction networks from large-scale CLIP-Seq data[J].Nucleic Acids Res，2014，42：D92-97.

[11]Li JH，Liu S，Zheng LL，et al.Discovery of protein-lncRNA interactions by integrating large-scale CLIP-Seq and RNA-Seq datasets[J].Front Bioeng Biotechnol，2014，14（2）：88.

[12]劉磊，于宗良，邓红平.miR-328在心血管疾病和肿瘤中的应用[J].医学综述，2018，24（3）：476-480.

[13]陈文江，陈灿.微RNA与心房颤动发病机制的研究进展[J].医学综述，2015，21（5）：801-803.

[14]刘长召，王玲，陈文江，等.微小RNA与心脏电重构的研究进展[J].中国医学创新，2015，12（18）：154-156.

[15]Zhao D，Li C，Yan H，et al.Cardiomyocyte derived miR-328 promotes cardiac fibrosis by paracrinely regulating adjacent fibroblasts[J].Cell Physiol Biochem，2018，46（4）：1555-1565.

[16]冯荣，傅广，黄树斌，等.miR-328、miR-147和miR-22在冠心病患者中的表达变化及临床意义[J].中国动脉硬化杂志，2015，23（8）：812-816.

[17]王玺，邱春光，黄振文，等.血浆miR-328在心房颤动中的表达水平及其临床意义[J].中华心血管病杂志，2013， 41（2）：126-129.

[18]Soeki T，Matsuura T，Tobiume T，et al.Clinical，electrocardiographic，and echocardiographic parameter combination predicts the onset of atrial fibrillation[J].Circ J，2018，82（9）：2253-2258.

[19]Soeki T，Matsuura T，Bando S，et al.Relationship between local production of microRNA-328 and atrial substrate remodeling in atrial fibrillation[J].J Cardiol，2016，68（6）：472-477.

[20]McManus DD，Lin H，Tanriverdi K，et al.Relations between circulating microRNAs and atrial fibrillation：data from the Framingham Offspring Study[J].Heart Rhythm，2014，11（4）：663-669.

（收稿日期：2018-10-24  本文编辑：刘克明）