SRSF6在非小细胞肺癌中的表达及意义

梅娟娟 利桂河 黄伟华

[摘要]目的 探讨富含丝氨酸-精氨酸剪接因子6（SRSF6）在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达及意义。方法 选取2013年1月～2017年1月我院收治的75例NSCLC患者作为研究对象，按照取材的不同分为非小细胞肺癌组织与相应癌旁组织，采用免疫组化SP法检测非小细胞肺癌组织与相应癌旁组织中的SRSF6蛋白表达水平，同时分析SRSF6表达与NSCLC患者性别、年龄、临床分期、是否发生远处转移、分化程度之间的关系。结果 SRSF6在NSCLC组织中的阳性表达为（1.65±0.48）%，明显高于癌旁组织的（0.57±0.23）%，差异有统计学意义（P<0.05）;调查SRSF6与NSCLC患者临床参数的关系，并根据肺癌组织中的SRSF6表达强度分为-、+、++、+++四组，发现SRSF6表达与NSCLC患者年龄和性别无关，差异无统计学意义（P>0.05），与临床分期、是否发生远处转移和分化程度有关，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 SRSF6在癌旁组织中表达较少，在NSCLC中高表达，为NSCLC的临床诊断和治疗提供理论依据，有助于为临床治疗提供新思路。

[关键词]富含丝氨酸-精氨酸剪接因子;非小细胞肺癌;生存率;临床特征

[中图分类号] R734.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2019）6（a）-0012-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and significance of serine/arginine-rich splicing factor 6 （SRSF6） in non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods Seventy-five patients with NSCLC admitted to our hospital from January 2013 to January 2017 were selected as the study subjects and divided into non-small cell lung cancer （NSCLC） tissues and corresponding adjacent tissues according to the different samples， the expression of SRSF6 in non-small cell lung cancer （NSCLC） and its adjacent tissues was detected by immunohistochemical SP method， the relationship between the expression of SRSF6 and gender， age， clinical stage， distant metastasis and differentiation of NSCLC was also analyzed. Results The positive expression of SRSF6 in NSCLC tissues was （1.65±0.48）%， which was significantly higher than （0.57±0.23）% in adjacent tissues， the difference was statistically significant （P<0.05）. To investigate the relationship between SRSF6 and clinical parameters of patients with NSCLC， and according to the expression intensity of SRSF6 in lung cancer tissues， SRSF6 was divided into four groups： -， +， ++， +++， it was found that SRSF6 expression was not related to age and sex of patients with NSCLC， and there was no significant difference （P>0.05）. There were significant differences in clinical stage， distant metastasis and differentiation， the difference was statistically significant （P<0.05）. Conclusion SRSF6 is less expressed in adjacent tissues and highly expressed in NSCLC， which provides a theoretical basis for clinical diagnosis and treatment of NSCLC， and helps to provide new ideas for clinical treatment.

[Key words] Serine/arginine-rich splicing factor; Non-small cell lung cancer; Survival rate; Clinical features

肺癌主要為两种类型的病理分型，即小细胞癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。其中最常见的是NSCLC，占全部肺癌发病率的80%～85%[1]。尽管近年来我国医疗技术不断发展，但NSCLC的发病率和死亡率仍未受到明显控制。目前肺癌的早期诊断仍存在缺陷和不足，导致临床上仅有20%～25%的NSCLC可获得早期诊断[2]。因此，通过研究肺癌的发病机制，寻找准确可靠的肺癌早期诊断和治疗的标志物，已成为临床肺癌疾病亟待解决的问题[3]。SR蛋白家族属于富含丝氨酸-精氨酸的蛋白质，在前体RNA的剪接中起着极其重要的作用，其中富含丝氨酸-精氨酸剪接因子6（SRSF6）作为SR蛋白家族的主要成员之一，在多种肿瘤中存在着拷贝数扩增的现象[4-5]。本研究选取我院收治的75例NSCLC患者作为研究对象，切除患者癌组织及癌旁组织，采用免疫组织化学染色方法检测SRSF6表达，并分析SRSF6表达与NSCLC患者临床参数的关系，现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选取2013年1月～2017年1月我院收治的75例NSCLC患者作为研究对象，按照取材的不同分为非小细胞肺癌组织与相应癌旁组织。其中男48例，女27例;年龄35～78岁，平均（56.51±4.28）岁。

纳入标准：①经病理或组织学确诊为NSCLC，同时实施手术的患者;②对本研究知情同意者;③本研究已经医院医学伦理委员会审核批准。排除标准：①存在凝血功能障碍、肝肾功能障碍等放化疗禁忌证者;②妊娠或哺乳期患者;③临床资料不完整者;④合并精神疾病患者;⑤伴有活动性感染及其他肿瘤者。

1.2方法

收集相关病例及患者临床参数，应用免疫组化的方法对组织中SRSF6的表达进行检测，具体检测方法如下。①术中分别取NSCLC组织及癌旁组织，以4%多聚甲醛固定24 h，常规70%、80%、90%、95%及无水乙醇逐级脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。将脱水后石蜡包埋的组织块经切片机行5 μm切片，干烤半个小时后置于二甲苯脱蜡30 min，梯度乙醇脱水各10 min，纯水洗5 min×2次，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，置于37℃ 3% H2O2中30 min消除内源性过氧化物酶，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，微波炉中抗原修复，冷却至室温，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，5% BSA 37℃孵育30 min，倾去不洗，滴加一抗后置于4℃湿盒过夜，复温，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，滴加SABC 37℃ 孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，滴加IgG 37℃孵育30 min，0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，DAB显色，自来水冲洗终止显色，苏木素轻度复染，梯度乙醇水化，二甲苯透明，中性树胶封片。免疫组化SP试剂盒（批号：SP-0023）和DAB显色试剂盒（批号：PW017）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，仪器为莱卡全自动免疫组化仪（徕卡显微系统（上海）贸易有限公司，型号：BOND-MAX）、莱卡光学显微镜（德国LeicaLASXCore）。

1.3观察指标及评价标准

采用免疫组化法检测NSCLC组织与相应癌旁组织中的SRSF6阳性表达，并进行比较;同时分析SRSF6表达与非小细胞肺癌患者性别、年龄、临床分期、是否发生远处转移、分化程度之间的关系。阳性细胞的胞浆呈淡黄色或棕黄色，阳性细胞计数通过两阶段评分法进行：在光学显微镜（400×）下，每个切片选择5个视野，每个视野计数100个细胞，总计500个。计算每个切片的阳性细胞百分比：阳性细胞数≤5%，0分;5%～<25%，1分;25%～<50%，2分;50%～<75%，3分;≥75%，4分。染色强度：淡黄色1分;棕黄色2分;棕褐色3分。两者相加：0～1分为阴性（-）;>1～3分为弱阳性（+）;>3～5分为中度阳性（++）;>5～7分为强阳性（+++）[6-7]。

1.4统计学方法

采用统计学软件SPSS 19.0分析数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验;计数资料以率表示，采用χ2检验;多因素分析采用Logistic回归分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1免疫组化法检测SRSF6在癌旁组织及NSCLC组织中的阳性表达

SRSF6在NSCLC组织和癌旁组织中均有表达。在NSCLC原发灶组织中SRSF6一般呈弥漫性、失极性表达，染色的程度增高，且大部分位于细胞膜与细胞浆中;在癌旁组织中仅在远曲小管与集合管细胞的细胞膜与细胞浆中存在表达，染色的强度为弱阳性（图1）。SRSF6在NSCLC癌组织中的阳性表达为（1.65±0.48）%，明显高于癌旁组织的（0.57±0.23）%，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 SRSF6表达与NSCLC患者临床参数的关系

根据肺癌组织中的SRSF6表达强度分为-、+、++、+++四组，SRSF6表达与NSCLC患者年龄和性别无关，差异无统计学意义（P>0.05），与临床分期、是否发生远处转移和分化程度有关，差异有统计学意义（P<0.05）（表1）。

2.3 SRSF6表达与NSCLC患者相关指标的多因素分析

SRSF6表达与NSCLC患者的临床分期、是否发生远处转移和分化程度有关，差异有统计学意义（P<0.05）（表2）。

3讨论

近年来，随着手术改进和麻醉技术的不断发展与创新以及新型化疗药物的不断问世，肺癌的综合治疗技术已逐渐成熟，但在过去的50年中，肺癌的5年生存率并未得到显著提高，肺癌的死亡率在5年內仍高达85%[8]。相关研究提出，若能有效提高肺癌的早期诊断，可明显改善肺癌的治疗和预后效果[9]。目前，经过多年肺癌的诊断和治疗经验以及肺癌相关研究的进展，逐渐形成了结构图像、功能影像学检查、痰细胞学、内镜检查、临床症状性肺癌的诊断模型，最终以组织病理学检查为诊断的金标准，可有效调节和指导肺癌的诊断和治疗，提高肺癌的诊治水平[10-12]。然而，目前对于无症状肺癌，仍缺乏有效的早期诊断方法，这是目前导致肺癌死亡的主要原因[13]。因此，临床将早期NSCLC地诊断及预后评估作为NSCLC防治的重要内容。SR蛋白家族属于丝氨酸-精氨酸富集蛋白，其在前体RNA的剪接过程中发挥着极为重要的作用，SR蛋白能够识别结合前体RNA上的剪接元件，继而招募组装剪接体，促进或抑制剪接事件的发生[14-15]。肿瘤中，SR蛋白的异常表达导致RNA异常剪接，从而促进肿瘤细胞的增殖及迁移，抑制肿瘤的凋亡。近期报道[16]，作为经典的SR蛋白，剪接因子SRSF6属于一个癌基因，能够调控大量的下游基因发生异常的可变剪接，在广泛的肿瘤相关机制中发挥着重要的作用。此外，其他的SR蛋白家族成员也与肿瘤的发生与发展存在着密不可分的联系。例如，SRSF6在肝癌中高表迗，并且与肿瘤的进程相关;在结肠癌以及卵巢癌中，高表迖的SRSF6与肿瘤细胞的转化以及生长相关;SRSF6被报道与血管内皮生长因子（VEGF）两种不同功能的转录本（促血管生成转录本VEGF165以及抑血管生成转录本VEGF165）表达相关。以上结果提示SR蛋白可以作为肿瘤的重要的检测指标。

SRSF6作为SR蛋白家族的主要成员之一，在皮肤癌中，高表达水平SRSF6能够导致细胞黏合素C（TNC）基因的异常可变剪接，从而促进皮肤癌的增殖[17]。谷雪梅等[18]在结直肠癌的研究中发现，SRSF6在结直肠癌高表达，并通过调控ZO-1的表达，影响癌细胞侵袭及转移，进而影响结直肠癌的治疗效果及预后。本研究进一步调查SRSF6在NSCLC中的表达及意义显示，SRSF6在NSCLC原发灶组织中弥漫性高表达，在癌旁肺组织中低表达;调查SRSF6与NSCLC患者临床参数的关系，并根据肺癌组织中的SRSF6表达强度分为-、+、++、+++四组，发现SRSF6表达与NSCLC患者的年龄和性别无关，差异无统计学意义（P>0.05），与临床分期、是否发生远处转移和分化程度有关，差异有统计学意义（P<0.05），提示Ⅳ期、淋巴结转移以及中高分化是SRSF6阳性表达的主要影响因素。检测SRSF6的表达对于评估肺癌发生发展的生物学行为具有一定的参考价值，在评估手术预后时将肿瘤分化程度与SRSF6表达强度相互结合，可能会达到更好的评估效果。

综上所述，SRSF6在癌旁组织中表达较少，在NSCLC中高表达，为NSCLC的临床诊断和治疗提供理论依据，有助于为临床治疗提供新思路。

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（收稿日期：2019-01-22  本文编辑：刘克明）