去泛素化酶3在肝癌细胞增殖、上皮间质转化、迁移和侵袭中的作用及机制

杨勤 李婷婷 简长春 雍熙

1川北医学院附属医院（四川南充637000）；2川北医学院附属第二医院（四川南充637199）

肝细胞癌是世界范围内第五大常见的癌症类型，也是第三大与癌症相关的死亡原因［1］。肝癌的预后非常不理想，可能与诊断较晚、化疗耐药、缺乏有效的治疗方法、术后复发率和转移性高等原因有关［2］。此外，肝癌发生和转移的分子机制尚不清楚。因此，迫切需要阐明介导肝细胞癌进展和转移的机制，发展更有效的治疗方法以提高肝癌患者生存率。

去泛素化酶3（deubiquitinating enzyme 3，Dub3）属于泛素特异性蛋白酶家族成员，可以拮抗E3 泛素连接酶介导的蛋白质泛素化和降解，可将靶蛋白去除泛素修饰以促进蛋白质稳定［3-5］。研究［6-8］发现，Dub3 可与CDC25A、SNAIL 等致癌蛋白特异性结合，并且稳定它们以促进鼻咽癌等细胞转移和侵袭。但是，Dub3 在肝癌细胞中的表达情况尚无报道，因此本研究使用RNA 干扰技术沉默Dub3表达，以研究Dub3 在肝癌细胞增殖、上皮间质转化、迁移和侵袭中的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂siRNA-Dub3 和siRNA-Control 序列由吉凯基因公司设计和合成；HepG2 细胞购于中科院上海细胞库；LipofectamineTM2000 购于Invitrogen公司；一抗购于Santa Cruz 公司；二抗购于Proteintech 公司；Trizol 购于Promega 公司；逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购于Takara 公司。

1.2 细胞培养和转染用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养HepG2 细胞。将HepG2 细胞随机分为Blank 组、siRNA-Control 组和siRNA-Dub3 组。当汇合度达到60%时，使用LipofectamineTM2000 进行转染实验。Blank 组细胞不进行转染。

1.3 蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）转染48 h 后，取3 组细胞行常规WB 检测［9］。一抗稀释比例为：Dub3（1∶500）、E-cadherin（1∶1 000）、claudin-1（1∶1 000）、N-cadherin（1∶1 000）、vimentin（1∶1 000）、MMP2（1∶1 000）、MMP9（1∶1 000）、snail（1∶500）、slug（1∶500）、twist（1∶500）、GAPDH（1∶3 000）。

1.4 荧光定量聚合酶链式反应（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）转染48 h 后，收集3 组细胞，Trizol 法提取总mRNA，逆转录试剂盒反转录成cDNA，荧光定量PCR 试剂盒进行PCR 扩增。Dub3 上游引物：5′-CTATCATTGCGGTCTTTGTCTCC-3′，下游引物：5′-AAGTGATGCTACAGGCAGTGA；GAPDH 上游引物：5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，下游引物：5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC。2-ΔΔCt法计算Dub3的相对表达量［10］。

1.5 MTT 试验转染24 h 后，将3 组细胞接种于96孔板，培养24、48和72 h后，加入20 μL的MTT溶液（5 mg/mL），孵育4 h，加入150 μL的DMSO，震荡5 min后，于450 nm波长下测定吸光度值（OD值）。

1.6 Transwell 试验在侵袭试验中，将20 μL的Matrigel 基质胶铺于Transwell的上室底部，其余步骤与迁移试验相同。转染24 h后，将含有6×104个细胞的200 μL悬液加入上室，下室中加入800 μL培养液，培养24 h。取出小室，多聚甲醛固定20 min，结晶紫染色30 min，蒸馏水冲洗。显微镜下（×100）计算细胞数量。

1.7 细胞免疫荧光染色转染48 h 后，多聚甲醛固定20 min，5%的牛血清白蛋白封闭30 min，加入抗E-cadherin 抗体（1∶100）和抗N-cadherin 抗体（1∶100）4 ℃孵育过夜。PBS 洗涤，加入二抗37 ℃孵育30 min，PBS 洗涤，加入DAPI 染色10 min，PBS洗涤后，荧光显微镜拍照（×200）。

1.8 统计学方法使用SPSS 20.0 软件进行统计分析。计量数据均表示为均数±标准差，多组计量数据比较使用单因素方差分析，两组间比较使用LSD-t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNA-Dub3 对HepG2 细胞的沉默效果与Blank 组和siRNA-Control 组相比，siRNA-Dub3 组细胞中Dub3 蛋白质和mRNA的表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05，图1、表1）。

图1 WB 检测Dub3 蛋白质的表达情况Fig.1 WB was used to detect the protein expression of Dub3

表1 3 组细胞中Dub3 蛋白质和mRNA 表达的比较Tab.1 Comparison of the protein and RNA expression of Dub3 among three groups ±s

表1 3 组细胞中Dub3 蛋白质和mRNA 表达的比较Tab.1 Comparison of the protein and RNA expression of Dub3 among three groups ±s

注：与Blank组相比，aP ＜0.05；与siRNA-Control组相比，bP ＜0.05

组别Blank 组siRNA-Control 组siRNA-Dub3 组F 值P 值蛋白质1.00±0.15 0.94±0.18 0.25±0.13ab 72.580＜0.001 mRNA 1.00±0.17 1.03±0.16 0.22±0.15ab 82.170＜0.001

2.2 siRNA-Dub3 对HepG2 细胞增殖的影响与Blank 组和siRNA-Control 组相比，siRNA-Dub3 组细胞在培养48 和72 h 时的OD值降低，差异有统计学意义（P＜0.05，图2、表2）。

图2 MTT 试验检测细胞的增殖Fig.2 MTT test was used to detect the cell proliferation

表2 3 组细胞间细胞增殖的比较（OD 值）Tab.2 Comparison of cell proliferation among three groups（OD） ±s

表2 3 组细胞间细胞增殖的比较（OD 值）Tab.2 Comparison of cell proliferation among three groups（OD） ±s

注：与Blank组相比，aP ＜0.05；与siRNA-Control组相比，bP ＜0.05

组别Blank 组siRNA-Control 组siRNA-Dub3 组F 值P 值24 h 0.471±0.049 0.483±0.044 0.440±0.038 2.555 0.096 48 h 0.675±0.088 0.654±0.082 0.526±0.059ab 10.870＜0.001 72 h 0.916±0.095 0.907±0.091 0.725±0.083ab 14.400＜0.001

图3 细胞免疫荧光染色检测E-cadherin 和N-cadherin的表达（×200）Fig.3 Immunofluorescence staining was used to detect the expression of E-cadherin and N-cadherin（×200）

2.3 siRNA-Dub3 对HepG2 细胞中EMT 相关蛋白表达的影响与Blank 组和siRNA-Control 组相比，siRNA-Dub3 组细胞的E-cadherin 荧光强度升高，N-cadherin 荧光强度降低（图3）。与Blank组和siRNA-Control 组相比，siRNA-Dub3 组细胞中E-cadherin、claudin-1 表达上升，N-cadherin、vimentin 表达降低（P＜0.05，图4、表3）。

2.4 siRNA-Dub3 对HepG2 细胞中基质金属蛋白酶表达的影响与Blank 组和siRNA-Control 组相比，siRNA-Dub3 组细胞中MMP2 和MMP9 表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05，图5、表4）。

2.5 siRNA-Dub3 对HepG2 细胞迁移和侵袭的影响与Blank 组和siRNA-Control 组相比，siRNADub3 组细胞的迁移和侵袭数量降低，差异有统计学意义（P＜0.05，图6、表5）。

2.6 siRNA-Dub3 对HepG2 细胞中snail、slug 和twist 表达的影响与Blank 组和siRNA-Control组相比，siRNA-Dub3 组细胞中snail、slug 和twist表达降低，差异有统计学意义（P＜0.05，图7、表6）。

图4 WB 检测EMT 相关蛋白的表达情况Fig.4 WB was used to detect the expression of EMT-related protein

3 讨论

泛素化是控制众多蛋白质功能的关键机制，参与调节DNA 修复等生理过程［11］。蛋白质的泛素化

是可逆的，去泛素化酶便是参与这一过程的关键酶，主要通过水解聚泛素链将泛素蛋白从靶蛋白上解离［12］。Dub3 是一种去泛素化酶，可通过调节Ras信号通路等机制促进细胞增殖［3］。Dub3 在多种肿瘤细胞系中高表达，如ZHOU 等［13］发现Dub3 在卵巢癌组织呈强阳性染色，其表达与淋巴结转移、临床分期密切相关，是卵巢癌患者生存的独立预后因子。但是，Dub3是否参与肝癌的进展尚不清楚。

表3 3 组细胞中EMT 相关蛋白表达的比较Tab.3 Comparison of the expression of EMT-related protein among three groups ±s

表3 3 组细胞中EMT 相关蛋白表达的比较Tab.3 Comparison of the expression of EMT-related protein among three groups ±s

注：与Blank组相比，aP ＜0.05；与siRNA-Control组相比，bP ＜0.05

组别Blank组siRNA-Control组siRNA-Dub3组F值P值E-cadherin 1.00±0.18 1.06±0.21 2.29±0.34ab 82.790＜0.001 claudin-1 1.00±0.19 0.97±0.18 2.76±0.41ab 133.200＜0.001 N-cadherin 1.00±0.21 1.02±0.17 0.55±0.23ab 16.830＜0.001 vimentin 1.00±0.16 0.95±0.20 0.47±0.21ab 23.420＜0.001

图5 WB 检测基质金属蛋白酶的表达情况Fig.5 WB was used to detect the expression of matrix metalloproteinase

表4 3 组细胞中基质金属蛋白酶表达的比较Tab.4 Comparison of the expression of matrix metalloproteinase among three groups ±s

表4 3 组细胞中基质金属蛋白酶表达的比较Tab.4 Comparison of the expression of matrix metalloproteinase among three groups ±s

注：与Blank组相比，aP ＜0.05；与siRNA-Control组相比，bP ＜0.05

组别Blank 组siRNA-Control 组siRNA-Dub3 组F 值P 值MMP-2 1.00±0.21 1.07±0.25 0.49±0.16ab 22.750＜0.001 MMP-9 1.00±0.18 0.95±0.20 0.35±0.12ab 45.220＜0.001

表5 3 组细胞间迁移和侵袭的比较（n=10）Tab.5 Comparison of the migration and invasion among three groups ±s

表5 3 组细胞间迁移和侵袭的比较（n=10）Tab.5 Comparison of the migration and invasion among three groups ±s

注：与Blank 组相比，aP ＜0.05；与siRNA-Control 组相比，bP ＜0.05

组别Blank 组siRNA-Control 组siRNA-Dub3 组F 值P 值迁移185.23±13.40 177.52±11.61 59.15±7.63ab 402.200＜0.001侵袭92.47±9.13 98.65±8.06 51.30±6.22ab 106.300＜0.001

图6 Transwell 试验检测细胞的迁移和侵袭（×100）Fig.6 Transwell assay was used to examine the migration and invasion（×100）

图7 WB 检测snail、slug 和twist的表达情况Fig.7 WB was used to detect the expression of snail，slug and twist

表6 3 组细胞中snail、slug 和twist 表达的比较Tab.6 Comparison of the expression of snail，slug and twist among three groups ±s

表6 3 组细胞中snail、slug 和twist 表达的比较Tab.6 Comparison of the expression of snail，slug and twist among three groups ±s

注：与Blank 组相比，aP ＜0.05；与siRNA-Control 组相比，bP ＜0.05

组别Blank 组siRNA-Control 组siRNA-Dub3 组F 值P 值snail 1.00±0.25 0.92±0.21 0.43±0.24ab 17.400＜0.001 slug 1.00±0.20 1.04±0.19 0.30±0.25ab 37.490＜0.001 twist 1.00±0.16 0.97±0.20 0.37±0.15ab 43.010＜0.001

本研究设计合成了Dub3的小干扰RNA，对HepG2 细胞转染后发现，与Blank 组和siRNAControl 组相比较，siRNA-Dub3 组细胞中Dub3 蛋白质和mRNA的表达降低，表明小干扰RNA 对Dub3的抑制效果较好。MTT 和Transwell 试验结果显示，与Blank 组和siRNA-Control 组相比较，siRNADub3 组细胞在培养48 和72 h 时的OD值降低，迁移和侵袭细胞数量降低，表明Dub3 沉默可以抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

上皮细胞的极性和细胞间连接减弱，向间质细胞表型转化，获得更强迁移能力，这一过程称为上皮间质转化。上皮间质转化是肝癌细胞的重要病理表现［14］，本研究结果显示Dub3 沉默可以促进上皮标志物的表达，降低间质标志物的表达，表明Dub3 沉默可以抑制上皮间质转化。基质金属蛋白酶的过度分泌在肿瘤细胞迁移和侵袭中发挥重要作用［15］，Dub3 沉默可以抑制肝癌细胞中MMP2和MMP9的表达，进一步证实了Dub3 在肝癌细胞迁移和侵袭中的关键作用。

Dub3 促进肿瘤细胞增殖的主要机制可能是Dub3 与CDC25A、Snail 等致癌因子结合，阻止泛素化修饰，维持致癌因子的稳定，如PEREG 等［16］在Dub3 敲低的细胞中发现，CDC25A的降解增强，导致Cdk/cyclin 复合体的活性降低，细胞停滞于G1/S 期和G2/M 期。本研究结果显示，与Blank 组和siRNA-Control 组相比较，siRNA-Dub3 组细胞中snail、slug 和twist的表达降低，表明Dub3 沉默可以下调snail、slug 和twist 表达，可能是抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制。

本研究的不足与展望：（1）本研究仅在细胞学水平对Dub3的生物学作用进行了探讨，但是体外细胞学实验无法有效模拟体内环境，下一步需要构建动物模型验证本研究结论；（2）Dub3 是否直接与snail、slug 和twist 等因子结合，并且促进其稳定，仍缺乏直接证据，下一步需要进行蛋白相互作用等实验进行验证。

综上所述，Dub3 沉默可以抑制肝癌细胞增殖、上皮间质转化、迁移和侵袭，可能与下调snail、slug和twist 表达有关。