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葡萄籽原花青素对自发性高血压大鼠肾纤维化的改善及肾损伤保护作用

2019-09-19刘尚军彭兴周志宏

实用医学杂志 2019年17期
关键词:肾脏抗氧化染色

刘尚军 彭兴 周志宏

1海南省第三人民医院心内科(海南三亚572000);2海口市人民医院(海口570208)

高血压是心脑血管病最常见的危险因素之一。原发性高血压(essential hypertension,EH)的特点是体循环动脉压升高,这可能是环境、遗传等多种危险因素相互作用造成的全身性疾病[1]。近年来研究报道EH 主要侧重于不同治疗方法及药物对自发性高血压大鼠(spontaneous hypertensive rats,SHR)血管及心脑肾等脏器炎症的改善作用[2],而临床研究多是观察药物对EH 患者血清炎症因子及血压的影响[3]。

肾脏是高血压损伤的靶器官之一,也参与了高血压的形成与发展。目前国内高血压肾病居慢性肾小球肾炎、糖尿病肾病后第三位,在国外则已成为终末期肾脏病(ESRD)第二位病因[4]。EH 所致的肾损害发病机制复杂,主要与血流动力学、血管内皮功能失调、自身抗体形成,还与炎症、氧化应激等因素相关,其中炎症反应是高血压引起肾脏病理改变的重要机制之一[5]。葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins,GSP)主要由儿茶素及表儿茶素组成,是从葡萄中提取出来的植物多酚类物质。研究发现,葡萄籽原花青素具有抗氧化(是VE的50 倍、VC的20 倍)、清除自由基、抗炎、抗动脉粥样硬化、抑制多种肿瘤细胞生长及保护血管内皮细胞等多种活性[6]。SHR 是目前公认的研究原发性高血压及其并发症的动物模型。因此,本研究选择SHR 作为高血压动物模型,观察GSP 对SHR 肾脏损伤的影响,从氧化应激、炎性反应等方面探讨GSP 减轻SHR 肾脏损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂葡萄籽原花青素(天津尖峰天然产物研究开发有限公司);HE 染色试剂盒(美国Sigma 公司);IL-6、TNF-α酶联免疫试剂盒(美国R & D 公司);BCA 蛋白质定量试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)及Masson 染色试剂盒均(南京建成生物工程研究所);NF-κB p-p65 兔抗大鼠抗体(美国CST 公司);TGF-β1 兔抗抗体(英国abcam 公司);实时定量PCR 仪(瑞士罗氏公司);病理图像分析系统Image-ProPlus5.0(美国Media Cybernetics 公司);大鼠尾动脉血压测量仪2006A(日本SoftronTM 公司)。

1.2 动物SPF 级雄性20 周龄SHR 大鼠30 只,同周龄雄性(Wistar-kyoto,WKY)大鼠10 只,体质量180~200 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证号:SCXK(京)2014-0001,单位使用许可证编号:SYXK(琼)2015-0023,本研究经本院伦理委员会审核通过(HNSDS-20180015)实验过程符合动物3R 原则。

1.3 方法

1.3.1 实验动物分组与给药30 只SHR 随机分成3 组(每组10 只),分别为SHR 模型组、GSP 低剂量组(100 mg/kg)GSP 高剂量组(250 mg/kg),选择Wistar-Kyoto(WKY)大鼠作为WKY对照组(n=10)。WKY 对照组和SHR 模型组每日均给予1 mL 0.9%生理盐水灌胃,GSP 低剂量组和GSP 高剂量组分别每日给予100、250 mg/kg GSP 灌胃,4 组大鼠灌胃22 周后进行检测处理。

1.3.2 实验标本留取用10%水合氯醛麻醉大鼠,抽取腹主动脉血,然后取部分左肾组织,4%多聚甲醛固定,其余肾组织分装在冻存管中,然后于液氮中保存。

1.3.3 大鼠尾动脉收缩压(SBP)的测定经22 周治疗后,43 周末时采用tail-cuff 测压法,用大鼠无创尾动脉压测定装置和多通道生理信号采集处理系统进行检测大鼠SBP。

1.3.4 HE 染色将取出的肾组织经4%多聚甲醛溶液固定,包埋,连续切片,厚度约3 μm,行HE 染色,光镜下观察肾组织病理学改变。

1.3.5 Masson 染色将制备好的切片置于乙醇中补水,Weigert 苏木精液中浸染5 min→浸入盐酸酒精进行分化2 min→丽春红酸性品红染色→苯胺蓝染色液染,以0.2%冰醋酸水溶液或蒸馏水浸洗片刻。乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固,在显微镜下观察染色结果。

1.3.6 肾组织中SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA 含量检测将大鼠肾组织制成10%的组织匀浆液,4 ℃下4 000 r/min 离心10 min 后取上清液,严格按照GSH-Px 、MDA 试剂盒说明书操作;肾组织混匀后,放置10 min,按照T-AOC、SOD 试剂盒操作说明检测。

1.3.7 ELISA检测肾组织中IL-6、TNF-α含量采用ELISA 法检测肾组织中IL-6、TNF-α 含量,操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.8 RT-qPCR 检测肾组织IL-6、TNF-α mRNA表达水平分别取各组肾组织30 mg,按总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒说明书分别提取各组总RNA 及逆转录合成cDNA 模板,取2 μL cDNA用于RT-qPCR 反应。β-actin 作为内参,独立实验重复3 次。用系统软件进行结果分析:样品的相对表达用2-ΔΔCt表示。

1.3.9 Western Blot法检测肾组织中NF-κB p-p65、TGF-β1 蛋白水平在肾组织(50 mg)中加1 mL 裂解液,冰上均浆,4 ℃下4 000 r/min 离心10 min,经BCA 法蛋白定量后上样,SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质、电泳、转膜后采用含5%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭1.5 h。加一抗,4 ℃冰箱过夜。加二抗37 ℃2 h,结束后用TBST 漂洗10 min × 3 次,显影后对蛋白质条带进行分析,测定其吸光度值。目的蛋白的相对表达强度=目的蛋白的吸光度值/GAPDH的吸光度值。

1.4 统计学方法采用SPSS 17.0 软件进行分析。计量资料采用()表示,数据服从正态分布及方差齐性,行单因素方差分析,P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 GSP 对自发性高血压大鼠SBP的影响22 周后,与WKY 对照组相比,SHR 各组SBP 值均明显升高(P<0.01),而SHR 各组间差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

2.2 各组大鼠肾组织HE 染色各组SHR 肾小球血管较WKY 对照组扩张充血,肾小管上皮细胞水肿,肾间质内有较多的血细胞渗出,肾小管间质内有较多的炎性细胞浸润。而与SHR 模型组比较,经低、高GSP 治疗后上述情况均缓解,炎性细胞浸润明显减少,见图1。

表1 GSP 对自发性高血压大鼠SBP的影响Tab.1 Effects of GSP on SBP in spontaneously hypertensive rats ±s

表1 GSP 对自发性高血压大鼠SBP的影响Tab.1 Effects of GSP on SBP in spontaneously hypertensive rats ±s

注:与WKY 对照组,*P<0.01

组别WKY 对照组SHR 模型组GSP 低剂量组GSP 高剂量组剂量(mg/kg)100 250给药后尾动脉收缩压(mmHg)130±13 190±10*176±13*180±9*

2.3 Masson染色结果观察经Masson染色后,胶原纤维被染成蓝色。WKY对照组大鼠肾间质中胶原纤维线样分布在肾小管、肾小球周围,SHR 魔此女孩组大鼠肾脏组织中胶原纤维较WKY 对照组显著增多。GSP 低、高剂量组大鼠肾脏的胶原纤维增多情况均有所减轻,特别是GSP高剂量组肾小球、肾小管周围胶原纤维分布较SHR模型组明显减少。见图2。

图1 各组大鼠肾组织HE 染色(×200)Fig.1 HE staining of kidney tissue in rats of each group(×200)

图2 各组大鼠肾组织Masson 染色(×400)Fig.2 Masson staining of kidney tissue in rats of each group(×400)

2.4 肾组织中SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA、TGF-β1 含量检测治疗22 周后,GSP 高剂量组中SOD、GSH-Px、T-AOC 值均较SHR 组明显升高(P<0.01),TGF-β1、MDA 含量显著降低(P<0.01),而GSP低剂量组中TGF-β1、MDA含量降低(P<0.05),SOD 活性亦升高(P<0.05)。SHR 模型组中SOD、GSH-Px 和T-AOC 值均较WKY 对照组明显降低(P<0.05,P<0.01),而TGF-β1、MDA 含量显著升高(P<0.01),其他指标之间差异无统计学意义。见表2。

表2 肾组织中TGF-β1、SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA 含量检测Tab.2 Detection of TGF-β1,SOD,GSH-Px,T-AOC and MDA in kidney tissues ±s

表2 肾组织中TGF-β1、SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA 含量检测Tab.2 Detection of TGF-β1,SOD,GSH-Px,T-AOC and MDA in kidney tissues ±s

注:与WKY 对照组相比,*P<0.05,**P<0.01;与SHR 模型组相比,#P<0.05,##P<0.01

组别WKY 对照组SHR 模型组GSP 低剂量组GSP 高剂量组SOD(U/mg)212±18.77 162±18.19*209±18.61#244±30.83##GSH-Px(U/mg)69.72±13.30 48.41±13.98*56.42±22.22 77.47±12.13##MDA(nmol/mg)10.55±2.05 20.08±5.78**14.50±0.83#9.20±1.23##T-AOC(U/mg)1.248±0.110 0.944±0.088**0.912±0.076 1.217±0.080##TGF-β1(mg/L)0.501±0.192 0.974±0.334*0.641±0.092#0.532±0.120##

2.5 GSP 对肾组织中炎性因子影响与SHR 模型组比较,低、高GSP 剂量组大鼠肾组织中IL-6 蛋白及mRNA 表达水平均明显下降(P<0.05);与SHR 模型组比较,低、高GSP 剂量组大鼠肾组织中TNF-α蛋白表达明显下降(P<0.05),而GSP 低剂量组中TNF-α mRNA 表达水平较SHR 模型组差异无统计学意义(P>0.05);SHR 各组大鼠肾组织中IL-6、TNF-α蛋白及mRNA 表达水平较WKY 对照组均明显提高,差异有统计学意义(P<0.01)。见图3。

图3 GSP 对肾组织中炎性因子IL-6、TNF-α 表达影响Fig.3 Effects of GSP on the expression of inflammatory factors IL-6 and TNF-α in renal tissue

2.6 Western Blot 检测结果与WKY 对照组比较,SHR 各组大鼠肾组织中p-p65 蛋白表达均明显上升(P<0.01),而SHR 模型组、GSP 低剂量组、GSP 高剂量组中p-p65 蛋白表达水平逐渐下降,差异有统计学意义(P<0.05)。见图4。

3 讨论

高血压病是我国最常见的心血管病之一,可引起心、脑、肾、眼等靶器官的并发症,高血压所致终末期肾病(ESRD)患病率呈逐年上升趋势[7],已取代肾小球疾病成为ESRD的第二病因[8]。临床防治ESRD 药物有限且常有副作用,如严重低血压、心律失常、高血钾等,因此寻找副作用较少且降低高血压肾功能损害的药物尤为重要。GSP 是从葡萄籽中提取的特殊分子结构生物类黄酮,主要由儿茶素及表儿茶素组成,具有抗癌、抗氧化、抗炎等药理活性[9],其活性与许多高血压肾损害的机制有关[10];研究发现[11],GSP 还具有缓解高血压所致心血管重塑及降低自发性高血压大鼠SBP的作用,这提示GSP 对SHR 肾损伤可能具有一定保护作用。

图4 p-p65 蛋白相对表达Fig.4 Relative expression of p-p65 protein

肾脏是高血压的主要靶器官之一,高血压肾损伤的病理机制主要与肾小球高压、肾脏自动调节功能失调、肾脏微血管结构和功能的改变等有关[12]。22 周后各组SBP 检测结果,与WKY 对照组相比,SHR 各组SBP 值均明显升高(P<0.01),而SHR 各组间差异无统计学意义(P>0.05),这提示本实验中GSP 对血压水平无明显影响;HE 染色结果表明,SHR 各组肾小球血管较WKY 对照组扩张充血,肾小管上皮细胞水肿,肾间质内有较多的血细胞渗出,肾小管间质内有较多的炎性细胞浸润,而GSP 治疗后能明显改善上述情况,这说明GSP能有效减轻肾组织炎性细胞浸润,抑制效果呈现剂量依赖性;经Masson 染色后,SHR 组大鼠肾脏组织中胶原纤维较WKY 对照组显著增多,而经低、高GSP 治疗后胶原纤维减少,同时经GSP 治疗后肾组织中TGF-β1 含量明显下降,这提示GSP 具有明显抑制纤维化作用。

MDA 可以反映细胞受自由基攻击后受损的状况,还能反映肾脏脂质过氧化程度,是机体内脂质过氧化的代谢产物之一[13];T-AOC 可以反应肾脏的总抗氧化能力的高低,是反应肾脏总抗氧化能力的重要指标;GSH-Px 是机体内重要的过氧化物分解酶,主要清除过氧化氢等自由基,防止脂质过氧化物的生成,保护细胞膜结构和功能完整性的作用;SOD 是酶促防御系的一种重要的氧自由基清除剂,其含量减少将导致自由基的堆积[14]。本研究结果显示,SHR 模型组中SOD、GSH-Px 和T-AOC 值均较WKY 对照组明显降低(P<0.05,P<0.01),而MDA 含量显著升高(P<0.01),说明抗氧化酶活性受到抑制,高血压大鼠肾脏处于氧化应激状态,肾脏的总抗氧化能力降低显著。治疗22 周后,GSP 高剂量组中SOD、GSH-Px、T-AOC值均较SHR 组明显升高(P<0.01),MDA 含量显著降低(P<0.01),这说明抗氧化酶活性明显恢复,同时肾脏的结构和功能损伤减轻,总抗氧化能力有所提高,GSP 能够对抗氧化应激反应,从而缓解SHR 肾损伤的作用。

NF-κB 在炎症反应中起着中心环节的作用,能够调控众多炎症因子(包括TNF-α、IL-6、IL-10等)的表达[15]。本研究中,SHR 各组大鼠肾组织中IL-6、TNF-α蛋白及mRNA 表达水平较WKY 对照组均明显提高。经过22 周的GSP 干预后,与SHR模型组比较,低、高GSP 剂量组大鼠肾组织中IL-6、TNF-α蛋白及mRNA表达水平均明显下降(P<0.05,P<0.01),同时SHR 大鼠肾内p-p65 蛋白活性表达降低,因此笔者得出:GSP 能够通过下调NF-κB 蛋白表达,从而使IL-6、TNF-α表达下降,抑制炎症反应,发挥肾脏保护作用。

本研究中,GSP 具有减轻SHR 肾损伤的作用,降低了脂质过氧化标志物MDA的水平,提高了抗氧化酶SOD、GSH-Px 及T-AOC 活性,下一步笔者将重点研究氧化应激通过哪些信号通路作用于NF-κB。

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