米糠发酵产γ-氨基丁酸条件优化的研究

2019-09-18刘元王玥玮张立娟

食品研究与开发 2019年18期

刘元，王玥玮，张立娟

（天津市食品研究所有限公司，天津301609）

米糠中保留了稻米中大部分的营养物质，其蛋白质的含量较高，且氨基酸组成丰富，营养全面，尤其是谷氨酸的含量很高[1]。谷氨酸是合成γ-氨基丁酸（gamma-aminobutyric，GABA）的重要原料。

γ-氨基丁酸又名4-氨基丁酸（4-Aminobutanoic acid，4-AB）和γ-氨酪酸，广泛存在于自然界，由谷氨酸（glutamic acid，Glu）经谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，EC 4.1.1.15，简称 GAD 或 GDC）催化而来，是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质[2]，它参与多种代谢活动，具有重要的生理功能，已报道的生理活性有调节血压、促使精神安定、促进脑部血流、增进脑活力、营养神经细胞、增加生长激素分泌、健肝利肾、预防肥胖、促进乙醇代谢（醒酒）、改善更年期综合症等多种功效[3-4]。

目前，γ-氨基丁酸（GABA）因其较好的生理功能和应用前景，已受到世界学术和企业界越来越多的关注和研究。而与国外相比，我国有关GABA 的研究开发报道较少，有待大力研究开发。GABA 作为一种新型的功能性因子正越来越引起国内人们的关注，对GABA的保健功能和作用机理的进一步深入探讨，必将对其应用起到极大的推动作用。

天然存在的GABA 很低，目前制备GABA 的方法主要包括化学合成法和生物合成法，生物合成法又包括植物富集法和微生物发酵法[1]。在早期研究中，利用大肠杆菌脱羧酶的作用，将L-谷氨酸转化为GABA，再分离纯化得GABA 制品[5]。但利用食用大肠杆菌进行食品开发存在一些安全方面的问题。Kono 等[6]对koji 制作中GABA 的变化进行了研究，GABA 含量达120 μg/g。乳酸菌己经广泛应用于酸奶、奶酪和泡菜等食品的生产，己经有很多研究表明乳酸菌具有GAD 活性，可以催化Glu 脱梭产生GABA[7]。

乳酸菌是具有极强GABA 发酵能力[8]，且被国际公认的食品安全级微生物，可直接用于食品和医药产业，因此本试验在传统的稻谷加工基础上，结合现代生物技术对米糠进行深加工，利用乳酸菌发酵生产GABA，具有广阔的市场前景。

1 材料和方法

1.1 材料

米糠：市售；嗜热链球菌S1、保加利亚乳杆菌L1：天津农学院提供；GABA 标准品：美国 sigma 公司；CaCl2、硼酸、苯酚、次氯酸钠、乙醇：天津市大茂化学试剂厂；L－谷氨酸钠：上海权旺生物科技有限公司；磷酸吡哆醛：汕头市西陇化工厂。

1.2 仪器和设备

ESJ205-4 型电子天平：沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；722 可见光分光光度计、DK-98-2 型电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；TG18G-II 高速离心机：湖南凯达科学仪器有限公司；SPX－150B 生化培养箱：天津市华北实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种传代与活化

参考杨丽丽等[9]和同仲彬等[1]的方法。

1.3.2 新鲜米糠预处理

新鲜米糠在60 ℃、20 min 的条件下进行热风干燥，之后进行粉碎处理，并过60 目筛。筛下物按照料液比1∶10（g/mL）的比例加入由蒸馏水配置的含0.10 mmol/L 磷酸吡哆醛及1.5 mmol/L CaCl2的溶液，并添加适量的L－谷氨酸钠，混合均匀，在115 ℃下灭菌15 min。

1.3.3 GABA 含量的测定

1.3.3.1 标准曲线

准确称取一定量的GABA 标准品用双蒸水配制成1 mol/L 的GABA 标准溶液，在做标准曲线的时候准确用双蒸水稀释GABA 标准溶液为 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L 有梯度的 GABA 标准溶液。从配制好的梯度标准溶液中分别取出1.0 mL，再依次加入0.2 mol/L 的硼酸缓冲液（pH=9）0.4 mL，6%的重蒸苯酚溶液1 mL，5.25%的次氯酸钠溶液1.5 mL，在混匀后立即放入沸水中水浴10 min，然后立即取出冰浴5 min，取出加60%的乙醇溶液2 mL，然后在640 nm 处测定溶液的吸光值，并以吸光值为纵坐标，GABA 含量为横坐标，绘制标准曲线，见图1。

图1 GABA 标准曲线Fig.1 GABA standard curve

经数据分析，其回归方程为y=0.981 2x+0.006 7，相关系数R2=0.999 8。

1.3.3.2 发酵液中GABA 的测定

在测定米糠发酵液中的GABA 含量时，取一定量的米糠发酵液在高速离心机以12 000 r/min 离心15 min，然后取1 mL，按照标准曲线测定方法进行米糠发酵液中GABA 含量的测定。

1.3.4 单因素试验

考察不同的发酵温度、发酵时间、乳酸菌添加量和嗜热链球菌S1 和保加利亚乳杆菌L1 比例对米糠发酵液中γ-氨基丁酸含量的影响，并确定出各因素的最佳水平。

1.3.4.1 发酵温度的确定

在菌种添加量为3%的条件下，用混合乳酸菌（嗜热链球菌S1∶保加利亚乳杆菌L1=1∶1）发酵米糠，设定发酵温度分别为 35、40、45、50、55 ℃，在此条件下发酵20 h，比色法测发酵液中GABA 含量，选取最佳发酵温度。

1.3.4.2 发酵时间的确定

在菌种添加量为3%、发酵液温度45 ℃的条件下，用混合乳酸菌（嗜热链球菌S1∶保加利亚乳杆菌L1=1∶1）发酵米糠，分别发酵 12、16、20、24、28 h，比色法测发酵液中GABA 含量，选取最佳发酵时间。

1.3.4.3 乳酸菌添加量的确定

用混合乳酸菌（嗜热链球菌S1∶保加利亚乳杆菌L1=1∶1）发酵米糠，在发酵液温度 45 ℃，菌种的添加量分别为1%、2%、3%、4%、5%的条件下发酵20 h，比色法测发酵液中GABA 含量，选取菌种最佳添加量。

1.3.4.4 嗜热链球菌S1 和保加利亚乳杆菌L1 比例的确定

在发酵温度45 ℃、发酵时间20 h、混合菌种添加量3%、嗜热链球菌S1∶保加利亚乳杆菌L1 分别为1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1 的条件下发酵米糠，比色法测发酵液中GABA 含量，选取菌种最佳比例。

1.3.5 正交试验

对于后混合式磨料射流技术仍存在一些问题。后混合磨料系统在加工精度、加工效率、加工能力等方面有待提高;对于后混合式磨料射流的流变特性、流场特性和本构方程等各项研究较少,对后混合式磨料射流流过喷嘴、射流与磨料混合、磨料加速、射流与大气的相互干扰、磨料颗粒冲击对材料的侵蚀和喷嘴移动速度对材料的体积去除率等也研究的较少。

GABA 发酵条件正交试验因素水平见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

根据单因素实验的结果，采用L9（34）正交试验对发酵温度、发酵时间、乳酸菌添加量、嗜热链球菌S1∶保加利亚乳杆菌L1 4 个因素进行优化，以发酵液中GABA 含量作为最终评价指标，确定发酵生产GABA的最优条件。

2 结果与分析

2.1 发酵温度对GABA含量的影响

发酵温度对GABA 含量的影响见图2。

由图2 可知，在35 ℃～55 ℃时，发酵液中GABA的含量先增加后降低，当温度上升到45 ℃时，GABA含量达到最大值，当温度大于45 ℃时GABA 含量明显降低，所以在45 ℃时，发酵液中GABA 含量较高，即为发酵的最适温度。

图2 发酵温度对GABA 含量的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on the content of GABA

2.2 发酵时间对GABA含量的影响

发酵时间对GABA 含量的影响见图3。

图3 发酵时间对GABA 含量的影响Fig.3 Effect of fermentation time on the content of GABA

由图3 可知，随发酵时间延长发酵液中GABA 含量呈先增加后减小的趋势，这可能是因为谷氨酸脱羧酶催化L-谷氨酸钠脱羧反应，使发酵pH 升高不利于生成GABA，且利于GABA 分解为琥珀酸和谷氨酸，与GABA 分解有关的酶是琥珀酸半醛脱氢酶和GABA 转氨酶，其最适pH 偏碱性。发酵24 h 时GABA 含量达到最大。

2.3 乳酸菌添加量对GABA含量的影响

乳酸菌添加量对GABA 含量的影响见图4。

图4 乳酸菌添加量对GABA 含量的影响Fig.4 Effect of adding amount of lactobacillus on the content of GABA

2.4 嗜热链球菌S1和保加利亚乳杆菌L1比例对GABA含量的影响

嗜热链球菌S1 和保加利亚乳杆菌L1 比例对GABA 含量的影响见图5。

图5 嗜热链球菌S1 和保加利亚乳杆菌L1 比例对GABA 含量的影响Fig.5 Effect of proportion of Streptococcus thermophilus S1 and Bulgaria Lactobacillus L1 on the content of GABA

由图5 可知，嗜热链球菌S1∶保加利亚乳杆菌L1为1∶2 时GABA 含量达到最大，因此混合菌种的最佳比例为，嗜热链球菌S1∶保加利亚乳杆菌L1=1∶2。

2.5 正交试验

正交试验结果见表2。

表2 正交试验结果Table 2 Result of experiment

由表2 可知：4 个因素对GABA 含量影响的重要性依次为C 乳酸菌添加量＞D 嗜热链球菌S1∶保加利亚乳杆菌L1＞A 发酵温度＞B 发酵时间。通过对比可以分别得到各因素最佳水平即理论优化发酵条件为：乳酸菌添加量3%、发酵温度48 ℃、嗜热链球菌S1∶保加利亚乳杆菌L1=1∶2、发酵时间24 h。在此条件下GABA 含量最高，为 320.61（mg/100 g）。

方差分析结果见表3。