刺参低聚肽的质量评价和抗疲劳作用研究

王祖哲，马普，王军琦，左爱华，彭聪，詹龙全，孙天利，包卫洋

（1.大连深蓝肽科技研发有限公司，辽宁大连116000；2.常熟理工学院，江苏常熟215500；3.大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连116023）

海参有主补元气、滋养五脏六腑和袪虚损的养生功能[1-2]。其中刺参（Apostichopus japonicus）是国内公认的营养价值最高的海参品种，且以产自辽宁的辽刺参最佳[3-4]。刺参中蛋白质含量丰富，是其主要功效成分[5-6]，所含氨基酸种类齐全，富含甘氨酸、羟脯氨酸、羟赖氨酸及精氨酸等碱性氨基酸[7-8]。但是海参蛋白分子量大，高达300 kDa，难以直接吸收利用，因此人们利用生物酶解技术把海参蛋白酶解成小分子的海参肽，海参肽具有溶解性、稳定性好、黏度低，易于消化吸收、生物效价高、无抗原性等优点，研究表明海参肽具有降血压、降血糖、抗氧化、提高免疫力、保护人体表皮细胞，防止黑色素沉淀、抗衰老等诸多功能[9-13]，具有广阔的开发及应用前景。

肽的质量是决定其功效的重要因素，由于所选海参原料、蛋白酶制剂、酶解条件及生产工艺的不同，海参肽的氨基酸组成、分子量大小及分布、低聚肽含量、营养成分、功效等均有所差别，目前国家尚未有统一的海参肽标准，市面上的一些海参肽产品质量参差不齐，鱼龙混杂，甚至出现一些假冒伪劣产品，造成了市场的混乱并危害人民的健康，因此有必要对海参肽的品质进行全面评价，为建立海参肽统一规范的质量标准提供依据。

虽然关于海参肽的抗疲劳作用已有报道，如卢连华、王洪涛、付学军等[14-16]研究了海参肽对小鼠的抗疲劳作用，但是这些研究所采用的海参肽或是企业提供，无任何产品相关信息，或来自实验室小规模制备，仅显示分子量大小。总之，所用海参肽的品质及质量均不明确，对仅有2～10 个氨基酸组成的刺参低聚肽的抗疲劳功效更没有明确报道。

本文在前期大量酶解工艺及生产工艺优化的基础上，以辽刺参为原料制备刺参低聚肽，并对刺参低聚肽的氨基酸组成、分子量分布、营养成分、微量元素、兽药及农药残留、食用安全性等进行质量评价，在此基础上依据《保健食品检验与评价技术规范》[17]选取负重游泳试验、血清尿素、肝糖原3 项生化指标，对刺参低聚肽的抗疲劳功效进行研究，并与目前市面上常用产品大豆低聚肽、海参粉的抗疲劳效果进行比较，为刺参低聚肽的广泛应用及抗疲劳保健品的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品

海参粉、辽刺参：大连鑫玉龙海洋生物种业科技股份有限公司；刺参低聚肽、大豆低聚肽：大连深蓝肽科技研发有限公司。

1.2 实验动物与主要试剂

健康的昆明种小鼠 300 只，体重（20±2）g，全部为雄性，购于大连医科大学，动物生产许可证号为SCXK（辽）2013-0003，使用许可证号为SYXK（辽）2013-0006。血清尿素氮（BUN）试剂盒、肝糖原试剂盒：南京建成生物工程研究所。

1.3 仪器设备

YS-08 型粉碎机：北京燕山正德机械设备有限公司；XS204SX 型电子秤：瑞士梅特勒仪器有限公司；UV752 型分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司；DK-S26 型恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；IECCL31R 型离心机：美国Thermo Scientific 公司；TG16-WS 高速冷冻离心机：湖南湘仪仪器有限公司；MDS-6（ECH-11）型微波消解仪：上海新仪微波化学科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 刺参低聚肽的制备

辽刺参经脱盐、斩碎、磨浆处理后加入复合蛋白酶酶解，酶解后经过离心、膜分离、除重金属、脱色、脱腥、脱盐与喷雾干燥等工艺分离制得刺参低聚肽粉。

1.4.2 质量指标检测

刺参低聚肽中蛋白含量采用GB/T 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法进行测定；灰分含量的测定依据GB/T 5009.4-2016《食品安全国家标准食品中灰分的测定》进行测定；水分含量依据GB/T 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》进行测定。微量元素由谱尼测试进行检测，兽药残留农药残留由SGS 检测，急性经口毒性试验由宁波出入境检验检疫局技术中心进行测试。

1.4.3 氨基酸组成及分子量分布测定

刺参低聚肽送江南大学分析测试中心，氨基酸组成采用GB/T5009.124-2003《食品中氨基酸的测定》方法测定，分子量分布按GB/T22729-2008《海洋鱼低聚肽粉》中高效凝胶过滤色谱法进行测定。

1.4.4 试验分组及灌胃剂量选择

将小鼠随机分为10 组，每组30 只，分别为阴性对照组；刺参低聚肽低、中、高剂量组；大豆低聚肽低、中、高剂量组；海参粉低、中、高剂量组，适应性饲养7 d 后灌胃。参考王洪涛等[11]对海参肽抗疲劳试验的给药剂量，设定低、中、高剂量组的灌胃剂量依次为0.085、0.17、0.50 g/kg。阴性对照组给予同体积的蒸馏水。各组小鼠每日灌胃1 次，每周称一次体重，连续灌胃30 d后，测定各项指标。

1.4.5 小鼠体重的测定

小鼠在灌胃前、灌胃1 周、灌胃2 周、灌胃3 周、灌胃4 周后分别称重，并做记录。

1.4.6 负重游泳实验

末次灌胃30 min 后，在小鼠尾部负7%体重的铅皮，放入水温（25±1）℃的游泳箱（100 cm × 100 cm ×80 cm）内，水深不低于30 cm，用秒表记录小鼠自游泳开始至溺亡的时间。

1.4.7 血清尿素氮的测定

末次灌胃30 min 后，将其置于温度为（30±1）℃的游泳箱中不负重游泳90 min，休息60 min 后采用拔眼球采全血约0.5 mL（不加抗凝剂）。放置4 ℃冰箱约3 h，待血凝固后于2 000 r/min 离心15 min，取血清按血尿素氮测定试剂盒说明书将各试剂加入到各个试管中。加完后混匀，置沸水中准确水浴15 min，立即用自来水冷却。在波长520 nm 处用紫外分光光度计测得吸光度值，计算出血清尿素氮的含量。

1.4.8 肝糖原的测定

末次灌胃30 min 后，采用断颈法将小鼠处死，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，按样本重量（mg）∶碱液体积（μL）=1∶3 加入试管中，沸水浴煮 20 min 后流水冷却。按肝糖原测定试剂盒说明书在各试管中加入各试剂，将肝糖原水解液进一步制备成糖原原液，混匀后置沸水中煮5 min，冷却后于620 nm 处用紫外分光光度计测得吸光度值，计算出肝糖原含量。

1.4.9 数据统计与分析

用SPSS 软件进行统计分析，采用独立样本的t 检验进行差异显著性检验，数据用平均值±标准偏差（D）表示[18]。

2 结果与讨论

2.1 刺参低聚肽的质量评价

采用复合蛋白酶制剂酶解，经过膜分离后的刺参低聚肽呈淡黄色或黄色粉状，具海参特有腥气，味微苦，无霉变，无异味，无肉眼可见杂质，各成分检测结果见表1。

表1 刺参低聚肽的检测结果Table 1 Detection results of Apostichopus japonicus oligopeptides

从表1 中可以看出，产品中总氮含量为12.3%，蛋白质含量为76.87%，表明蛋白质是其主要成分，水分及灰分含量较低。同时产品中含有镁、磷、钾、锌、铁、硒、锰等多种矿物质以及丰富的牛磺酸，牛磺酸是人体必需的营养元素，具有增强免疫力、改善记忆、预防心血管病及糖尿病、高血压等等重要生物学作用[19]，众多微量元素的存在有利于人体营养物质的补充。

刺参低聚肽的兽药及农药残留检测项目涉及多氯联苯类、氯霉素类、呋喃类代谢物、沙星类、磺胺类等多个指标，结果显示所有药物残留在刺参低聚肽中均未检出，极大保证了产品的安全性。

急性经口毒性试验依照GB15193.3-2014《食品安全国家标准急性经口毒性试验》标准进行测定，试验结果显示，样品经口半数致死量（LD50）＞10 000 mg/kg，根据急性毒性分级，该样品为实际无毒，是可放心安全的产品。

2.2 刺参低聚肽的氨基酸组成和分子量分布

刺参低聚肽中氨基酸组成及含量见表2。

由表2 可知，刺参低聚肽中氨基酸总量为82.91%，甘氨酸含量最高，依次为谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、羟脯氨酸、脯氨酸、亮氨酸，这些氨基酸的总量为57.11%，占氨基酸总量的68.89%，其中甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸含量较高，表明富含胶原蛋白；甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸影响学习记忆能力，高含量的此类氨基酸有助于提高学习记忆能力[20]；富含人体必需的7 种氨基酸（不含色氨酸）和2 种半必需氨基酸（组氨酸和精氨酸），总含量为25.85%，占氨基酸总量的31.18%，必须氨基酸含量较高；呈味氨基酸甘氨酸、丙氨酸和谷氨酸和天冬氨酸含量为40.93 %，占氨基酸总量的49.37%，呈现出产品特有的鲜味。此外，支链氨基酸和疏水性氨基酸含量较高，分别为12.7 3%和24.6%，有研究表明，支链氨基酸具有独特的生理功能，在调节免疫、抗疲劳及机体修复方面发挥重要作用[21-22]，疏水性氨基酸含量与抗氧化肽和ACE 抑制肽的活性密切相关[23-24]。

刺参低聚肽分子量分布结果见表3。

表3 刺参低聚肽分子量分布Table 3 Molecular weight distribution of Apostichopus japonicus oligopeptides

由表3 可知，分子量在1 000 Da 以下蛋白水解物占 99.58%，其中 1 000 Da～500 Da 占比 8.21%，500 Da～180 Da 占比57.44%，小于180 Da 占比33.93%，可以看出刺参低聚肽中500 Da～180 Da 的肽段比例最高，此分子量范围内主要由2～3 个氨基酸组成的小分子肽。研究表明分子量越小的肽，其吸收效果越好，功效越强[25-26]，尤其是2～3 个氨基酸组成的寡肽更容易穿越小肠粘膜直接被人体吸收利用[27-28]。因此同海参中大分子蛋白相比，刺参低聚肽产品属于小分子活性肽产品，更易于人体的消化吸收，吸收利用率更高，尤其适合消化功能较弱的人群。

2.3 对小鼠状态及体重的影响

刺参低聚肽、大豆低聚肽和海参粉对小鼠体重的影响见表4。

在30 d 灌胃试验过程中，各组小鼠在试验过程中饮食、饮水、毛发、大小便等情况均无异常。从表4 中各组小鼠受试30 d 体重增长情况可以看出，阴性对照组和实验组小鼠体重总体上都呈增长趋势，增长情况略有差异。经t 检验发现，受试组与对照组之间无显著性差异（p＞0.05）。结果表明，刺参低聚肽及大豆低聚肽、海参粉对小鼠体重均无显著影响。

表4 刺参低聚肽、大豆低聚肽和海参粉对小鼠体重的影响（D，n=10）Table 4 The effect of Apostichopus japonicus oligopeptides，soybean oligopeptides and sea cucumber powder on body weight of mice（D，n=10）g

表4 刺参低聚肽、大豆低聚肽和海参粉对小鼠体重的影响（D，n=10）Table 4 The effect of Apostichopus japonicus oligopeptides，soybean oligopeptides and sea cucumber powder on body weight of mice（D，n=10）g

组别 灌胃前体重 1 周体重 2 周体重 3 周体重 4 周体重阴性对照 20.30±1.09 25.76±1.12 29.17±0.76 35.33±0.71 38.40±0.62刺参低聚肽低剂量 20.65±1.61 26.77±1.39 31.03±1.39 36.23±1.50 38.77±1.29刺参低聚肽中剂量 20.88±1.20 26.09±0.88 29.77±0.80 35.83±1.36 38.73±1.40刺参低聚肽高剂量 20.78±1.09 26.09±1.09 28.50±2.65 35.33±0.64 38.13±0.55大豆低聚肽低剂量 22.15±1.69 27.95±1.84 30.17±1.21 36.60±0.72 39.10±1.21大豆低聚肽中剂量 21.09±1.81 26.14±1.45 29.58±0.60 35.07±1.40 38.50±1.55大豆低聚肽高剂量 20.47±0.69 25.75±1.22 30.66±1.43 35.32±0.92 38.60±0.79海参粉低剂量 20.12±0.80 26.13±0.65 29.00±1.37 35.07±0.87 38.10±0.40海参粉中剂量 21.49±0.67 26.50±0.56 29.99±0.74 35.62±1.08 39.07±0.70海参粉高剂量 20.80±1.26 26.45±1.05 30.10±0.98 35.90±0.70 38.83±0.55

2.4 对小鼠负重游泳时间的影响

刺参低聚肽、大豆低聚肽和海参粉对小鼠负重游泳时间的影响见图1。

图1 刺参低聚肽、大豆低聚肽和海参粉对小鼠负重游泳时间的影响Fig.1 The effect of Apostichopus japonicus oligopeptides，soybean oligopeptides and sea cucumber powder on loaded swimming time of mice

从图1 可以看出，与阴性对照组相比，海参粉各剂量组和对小鼠游泳时间无明显延长，表明低、中、高剂量组海参粉均不能延长小鼠的负重游泳时间。大豆低聚肽低剂量组对小鼠游泳时间无明显影响，而中、高剂量使小鼠的负重游泳时间明显延长，同阴性对照组相比存在明显差异，延长率分别为95.39%和96.16%。而刺参低聚肽低、中、高剂量组均能使小鼠的负重游泳时间明显延长，同阴性对照品相比具有显著差异（p＜0.05），增长率分别为93.08%、153.85%、167.31%。该结果表明刺参低聚肽能够极大延长小鼠的负重游泳时间，提高小鼠运动耐力，且低剂量组刺参低聚肽即可达到大豆低聚肽中、高剂量组的效果，作用强弱顺序为：刺参低聚肽＞大豆低聚肽＞海参粉。

2.5 对运动后小鼠血清尿素氮含量的影响

血尿素氮是蛋白质代谢分解终产物，运动后机体的血糖降低、糖原消耗，需要分解蛋白质满足对能量的需求，血清尿素氮作为能量代谢产物，是衡量机体疲劳程度的重要指标。

刺参低聚肽、大豆低聚肽和海参粉对运动后小鼠血清尿素氮含量的影响见图2。

图2 刺参低聚肽、大豆低聚肽和海参粉对运动后小鼠血清尿素氮含量的影响Fig.2 The effect of Apostichopus japonicus oligopeptides，soybean oligopeptides and sea cucumber powder on BUN content of mice

从图2 可以看出各实验组小鼠运动后的血清尿素氮含量明显低于阴性对照组，且呈差异显著（p＜0.05），结构表明刺参低聚肽、大豆低聚肽和海参粉的各剂量组均能够降低运动后小鼠的血清尿素氮含量，其中刺参低聚肽各剂量组的效果最好，明显低于大豆低聚肽组与海参粉组，但是，刺参低聚肽低、中、高剂量组之间差异并不明显，这表明较低的给药剂量即可明显改善小鼠的血清尿素氮含量，而无需大剂量给药，充分显示出了刺参低聚肽活性强的特点。

2.6 对小鼠肝糖原含量的影响

运动条件下，糖原会加速分解产生三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP），维持机体血糖平衡。因此，糖原含量高低是机体运动耐受力的重要标志，也是衡量疲劳程度的一项重要指标。

刺参低聚肽、大豆低聚肽和海参粉对小鼠肝糖原含量的影响见图3。

图3 刺参低聚肽、大豆低聚肽和海参粉对小鼠肝糖原含量的影响Fig.3 The effect of Apostichopus japonicus oligopeptides，soybean oligopeptides and sea cucumber powder on hepatic glycogen content of mice

从图3 中可以看出，与阴性对照组相比，各实验组小鼠的肝糖原含量均明显升高，其中海参粉的作用效果最弱，其次是大豆低聚肽，刺参低聚肽效果最好，能够极大提高小鼠肝糖原的含量，且呈极显著性差异，而中剂量的刺参低聚肽的效果最好，与阴性对照组相比肝糖原含量增长111.92%。而高剂量组的肝糖原含量反而低于中剂量组，此结果表明并非剂量越大效果越好，中等剂量是最佳剂量，此时剂量为0.17 g/kg。

3 结论

本文对刺参低聚肽的质量进行整体评价，结果显示刺参低聚肽产品中蛋白质含量高，氨基酸种类齐全，富含有多种人体必须氨基酸、呈味氨基酸、支链氨基酸及疏水性氨基酸。低聚肽含量高，分子量在1 000 Da以下的蛋白水解物占99.58%，且180 Da～500 Da 的肽段比例最高。产品质量符合各项指标，含有多种矿物质，营养成分全面，无重金属超标，无兽药及农药残留，产品质量佳，食用安全。在海洋重金属污染以及农药、兽药残留日益严重的当代，开发这样一款安全、有效、高营养价值的海参低聚肽产品是大势所趋。

本文研究并比较了刺参低聚肽、大豆低聚肽和海参粉的抗疲劳效果，结果发现，与阴性对照组相比，刺参低聚肽使得小鼠负重游泳时间明显延长，运动之后的血清尿素氮含量显著降低，体内糖原储备能力明显提高，证明了刺参低聚肽具有显著的抗疲劳功效。对比刺参低聚肽不同剂量组的实验数据可以发现，刺参低聚肽的剂量与抗疲劳效应不存在正相关，中剂量组的肝糖原增长率比低、高剂量组更加明显，而各剂量组的血清尿素氮降低率无明显差异，表明中剂量（0.17 g/kg）组的刺参低聚肽抗疲劳效果最好，为最佳剂量，此结果充分显示刺参低聚肽并非服用越多效果越好，中剂量是最佳抗疲劳剂量，换算为人体服用剂量约为0.8 g/d，此剂量的刺参低聚肽产品可起到明显的抗疲劳作用，为抗疲劳功能性食品及保健品的开发提供了科学依据。

进一步对比刺参低聚肽、大豆低聚肽及海参粉的抗疲劳效果，结果显示大豆低聚肽和海参粉也具有一定的抗疲劳作用，但相同剂量时，刺参低聚肽具有最佳的抗疲劳效果且呈差异显著，其作用强弱顺序为：刺参低聚肽＞大豆低聚肽＞海参粉。分析海参粉作用效果弱的原因，其中一个可能是海参粉进入机体之后需要经过进一步的消化才能被吸收，而低聚肽能够直接以完整的形式被小肠上皮细胞吸收[29]，且小分子肽更易于人体的消化吸收，利用率更高。

大豆肽具有抗疲劳、抗氧化、降血糖等多种功效[30-31]，在我国婴幼儿食品、老年食品、特殊人群营养补充剂等产品中已经得到广泛应用。相比大豆肽而言，海参肽的众多功能虽然已被研究证实，但并没有得到大规模的应用，原因可能与刺参低聚肽的价格昂贵有极大关系。本文研究结果表明，刺参低聚肽的抗疲劳效果明显好于大豆低聚肽，低剂量的海参肽即可起到很好的效果，此结论有助于降低海参肽的使用成本，扩大其应用范围，同时刺参低聚肽中富含多种人体必需氨基酸及各种营养物质，为刺参低聚肽这种高价值原料的作为功能性食品尤其是抗疲劳食品的应用提供了可靠的理论依据。

疲劳主要原因是肌体运动时产生大量的自由基破坏了细胞内外正常的物质交换，从而使机体的能量和物质代谢能力降低，有研究表明海参肽具有显著的抗氧化和增强免疫力作用[14，32]，推出海参肽可能通过抗氧化提高机体抗氧化酶活性以及增强免疫力起到抗疲劳的作用，具体的作用机制还有待于今后进一步的研究。