一种复合抗氧化果蔬酵素的开发及活性研究

杨志鹏，王建彬，文婷婷，韩墨，赵鑫君，张晶晶，王婷，*

（1.齐鲁工业大学（山东省科学院）山东省微生物工程重点实验室，山东济南250353；2.诸城东晓生物科技有限公司，山东诸城262200；3.山东省种子管理总站，山东济南250353）

自由基是维持正常生命所必需的物质，同时也是大分子、细胞的“危险杀手”。自Harman 首次提出衰老的自由基氧化应激学说以来，经过60 多年的发展，自由基氧化应激学说越来越被人群所接受，许多老龄化疾病的发病机制都与机体参与氧化应激有关[1]。究其原因，很大一方面是由于机体长期处于应激状态时，体内氧自由基的产生过多或清除自由基的酶类产生减少，氧自由基的产生和清除平衡遭到破坏，机体内部自由基清除能力减弱，导致细胞结构和功能的破坏，从而引起疾病和衰老[2-3]。果蔬中富含多种天然的抗氧化活性物质，如多酚类的白藜芦醇、黄酮类的芦丁、维生素C（抗坏血酸）、维生素B2（核黄素）、类胡萝卜素等，以及近期研究发现的番茄红素（lycopene）、类黄酮（flavonoids）及花青素（anthocyanin），以上物质均具有清除含氧自由基，调节机体内平衡，提高免疫力，延缓衰老的功能[4]。

酵素是指以动物、植物、菌类等为原料，经微生物发酵制得的含有特定生物活性成分的产品，其包含了天然营养物质、酶、有益微生物及其活性代谢物[5]。酵素产品日趋火热，也体现了大众认识到合理饮食对健康的重要性，但是目前对于功能性明确的酵素产品研究较少。精选天然抗氧化能力强的果蔬为原料，经益生菌分解和代谢，释放出其所含原花青素、多酚、维生素等天然功效成分，可直接参与人体新陈代谢，通过阻断自由基链反应，减少自由基的产生或清除自由基等形式提高机体的抗氧化能力，并具有潜在的抗炎、免疫调节和延缓机体衰老的功效[6-8]。因此，通过开发具有抗氧化功能的复合果蔬酵素并对其中天然活性成分进行研究，对开发具有潜在调节人体肠道菌群，防止脂质过氧化反应，清除体内自由基，延缓衰老、提高机体免疫力的功能食品具有指导意义。

1 材料与方法

1.1 菌株

鼠李糖乳杆菌 217-1、217-3、217-8 为齐鲁工业大学生物制药工程研究所保藏菌株[9]。

1.2 设备

RS232-C 分光光度计：上海元析仪器有限公司；UV-5500PC 离心机：湖南湘仪仪器开发有限公司；DJ1-012 打浆机：靖江舜天工业设备制造有限公司；LDZX-50KB 灭菌锅：上海复昌科技有限公司；SHP-150恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；FE20 酸度计：武汉永胜科技有限公司；LC-VP 高效液相色谱：日本岛津公司。

1.3 试剂和材料

乳酸菌培养基（Lactobacilli MRS broth）：海博生物有限公司；氯化钠、苯酚、浓硫酸、无水乙醇、葡萄糖、茚三酮、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、没食子酸、碳酸钠、福林酚试剂、盐酸、硫酸铁铵、正丁醇、异丙醇、甲酸（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；DPPH：Sigma 公司；甲醇、乙腈（色谱纯）：天津富宇精细化工有限公司；核黄素（维生素B2）标准品、原花青素标准品：上海源叶生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 抗氧化复合果蔬酵素的制备

选取柠檬、苹果、桑葚、菠萝、草莓、番茄等多种果蔬，清洗洁净后打浆。加入果胶酶酶解并调节pH 值为5～7，后 105 ℃灭菌 20 min。待温度降为 25 ℃～35 ℃时加入鼠李糖乳杆菌217-1、217-3 和217-8 进行37 ℃恒温发酵。酵素于超净工作台混匀后取样，后4 000 r/min 离心10 min，取上清液，待测。对照原溶液为果蔬打浆、酶解并调节pH 值后，4 000 r/min 离心10 min，取上清液，待测。

1.4.2 抗氧化果蔬酵素活菌数与pH 值的检测

采用平板计数法和pH 计分别检测酵素发酵阶段乳酸菌和pH 值的变化[5]。

接入乳酸菌后，从0 h 开始，每隔5 h 对酵素取样一次，持续10 次。于超净工作台中对一定量样品进行梯度稀释，后取适宜浓度梯度的酵素稀释液涂布于MRS 平板培养基上，37 ℃培养箱倒置培养24 h。取样品用pH 计检测酵素中的pH 值。

1.4.3 抗氧化果蔬酵素总糖含量的检测

采用苯酚-硫酸法检测酵素中的总糖含量[10]。

准确分别吸取100 mg/L 的葡萄糖标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于试管中并用蒸馏水补至 1.0 mL。向试管中加入1.0 mL 5%苯酚和5.0 mL 硫酸，静置10 min。涡旋振荡器使反应液充分混合，将试管放置于30 ℃水浴中反应20 min，490 nm 测吸光度。取1.0 mL的待测样品重复上述操作，测定其吸光度，计算样品的总糖含量。

1.4.4 抗氧化果蔬酵素多酚含量的检测

采用福林酚试剂法检测酵素中多酚含量[11]。

取没食子酸标准溶液配制 10、20、30、40、50 μg/mL的没食子酸工作液。分别取没食子酸工作液和蒸馏水各1 mL 于试管中，加入5.0 mL 10%福林酚试剂，反应5 min 后加入7.5%的Na2CO3溶液4 mL，摇匀后25 ℃放置60 min，于765 nm 波长下测定吸光度。取1.0 mL的待测样品重复上述操作，测定其吸光度，计算样品中多酚含量。

1.4.5 抗氧化果蔬酵素黄酮含量的检测

分别吸取 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 芦丁标准液于10 mL 容量瓶中，加入0.15 mL 质量分数为5%的NaNO2溶液，混匀放置6 min。加10%的Al（NO3）3溶液0.15mL，摇匀放置6min。最后加入2 mL 4%的NaOH 溶液，以甲醇定容至刻度，摇匀后放置15 min，于510 nm波长下测定吸光度[12]。取1.0 mL 的待测样品用甲醇定容于10 mL 容量瓶中，后取1 mL 提取液重复上述操作，测定其吸光度，计算样品中总黄酮含量。

1.4.6 抗氧化果蔬酵素核黄素的检测

采用高效液相色谱法检测酵素中核黄素的含量[13]。

取核黄素标准储备液混合、稀释、定容配制成质量浓度为100 μg/mL 的核黄素标准溶液，以此标准溶液为最高浓度稀释成系列标准溶液。分别以进样浓度为横坐标（X）、峰面积积分值（Y）为纵坐标绘制标准曲线并计算回归方程。同时吸取酵素样品进行液相色谱分析，根据标准曲线计算酵素中核黄素的含量。

色谱柱：Agilent Zorbax Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相 A：25 mmol/L 磷酸二氢钾缓冲液，B：乙腈；梯度洗脱条件：起始 5 min 内 100%A 洗脱，随后20 min 内A 相体积比由100%线性下降至75 %，保持5 min 后，恢复至100 % A 平衡色谱柱10 min；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样器温度：4 ℃；进样体积：20 μL；采集波长设定为 267 nm。

1.4.7 抗氧化果蔬酵素原花青素的研究

采用GB/T 22244-2008《保健食品中前花青素的测定》测定酵素中原花青素的含量。

液相条件为色谱柱：C18 柱；柱温：35 ℃；检测器：紫外检测器；检测波长：525 nm；进样量：10 μL；流动相（体积比）：水+甲醇+异丙醇+甲酸=73+13+6+8；流速：1.0 mL/min。

根据含量准确吸取1 mL～5 mL 样液，置于50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。将正丁醇与浓盐酸按95∶5 的体积比混合后，取出15 mL 置于具塞锥瓶中，再加入0.5 mL 硫酸铁铵溶液和2 mL 试样溶液，混匀，置沸水浴精确加热40 min 后，立即置冰水中冷却，经0.45 μm 滤膜过滤，进行高效液相色谱分析。

1.4.8 抗氧化果蔬酵素抗氧化性的研究

采用DPPH 自由基清除试验模拟机体内清除自由基。

取100 μL 各稀释梯度的样品溶液加至试管中，然后向每管加入3.9 mL 0.1 mmol/L 的DPPH 乙醇溶液，混匀，37 ℃避光水浴1 h 后于517 nm 下测定吸光度。以乙醇做空白对照，蒸馏水调零，每个样品均平行测定3 次，结果以IC50值表示。IC50是指DPPH 自由基清除率为50%时所对应的样品浓度[14]。DPPH 自由基清除率按下式计算：

式中：Ac 为空白对照管的吸光度；As 为样品测定管的吸光度。

2 结果与分析

2.1 抗氧化复合果蔬酵素发酵时间的确定

复合抗氧化果蔬酵素中pH 值和活菌数变化曲线见图1。

图1 复合抗氧化果蔬酵素中pH 值和活菌数变化曲线Fig.1 Change curve of pH value and number of living bacteria in Jiaosu

由图1 所示，在复合抗氧化果蔬酵素发酵过程中，0～5 h 乳酸菌处于延滞期，pH 值下降缓慢。5 h～25 h，乳酸菌处于对数期，鼠李糖乳杆菌快速增值，消耗C、N 源并产生大量的乳酸，pH 值由6.12 迅速下降至3.52。随着乳酸的积累和营养消耗，25 h～45 h 鼠李糖乳杆菌进入稳定期生长平稳，乳酸生成减少，pH 值缓慢下降并稳定在3.20 左右，因此将发酵时间确定为40 h～50 h。复合抗氧化果蔬酵素选用的鼠李糖乳杆菌217-1、217-3、217-8 分离于健康儿童的肠道菌群，经体外益生评价试验，具有显著的酸、胆盐、人工胃肠液耐受能力，同时高产 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和具备高效降胆固醇能力[9]。因此，以鼠李糖乳杆菌作为出发菌株发酵复合抗氧化果蔬，能够有效的将果蔬中的大分子物质转化为利于人体吸收利用的小分子成分，同时产生次级代谢产物，调节人体肠道菌群平衡、促进细胞分裂能力，防止脂质过氧化反应，清除体内自由基，提高机体免疫力，起到排毒养颜、延缓衰老的作用[15]。

2.2 抗氧化复合果蔬酵素发酵阶段总糖含量的变化趋势

复合抗氧化果蔬酵素总糖含量的变化趋势见图2。

图2 抗氧化果蔬酵素总糖含量变化曲线Fig.2 Change curve of total sugar content of Jiaosu

如图2 所示，复合抗氧化果蔬酵素的初始总糖含量是120.5 mg/mL。发酵30 h 的时候，总糖为35.29 mg/mL。当发酵进行到50 h 左右的时候，总糖浓度下降到了24.37 mg/mL。根据试验数据表明：发酵初期糖代谢较为旺盛，鼠李糖乳杆菌快速增值，是产生乳酸的关键时期。在发酵后期随菌株的生长受到抑制，糖代谢减缓，糖的利用率下降。

2.3 抗氧化复合果蔬酵素多酚和黄酮含量的检测对比

抗氧化果蔬酵素与原溶液中活性成分含量见图3。

图3 抗氧化果蔬酵素与原溶液中活性成分含量Fig.3 The content of active ingredients in Jiaosu and raw solution

酵素中多酚和黄酮含量如图3 所示，复合抗氧化果蔬酵素中的多酚含量为1.02×103mg/L，原溶液的含量为7.89×102mg/L，发酵后酵素中的多酚含量提升了29.3%。原溶液的黄酮含量为1.49×102mg/L，复合抗氧化果蔬酵素中的黄酮含量为2.07×102mg/L，较比于原溶液，经鼠李糖乳杆菌发酵后提高了38.9%。黄酮及多酚类化合物是植物中具有抗氧化、抗衰老等诸多生理活性的天然活性物质，其可作为抗氧化剂，提高机体清除自由基，减少组织细胞的氧化损伤；调节DNA、蛋白质等物质的合成，免受衰老因子的损伤；作为信号因子，调节基因表达，改善衰老机体代谢情况[6]。因此，酵素中多酚及黄酮类化合物含量的上升，具有清除体内自由基、延缓衰老的潜能。

2.4 抗氧化复合果蔬酵素核黄素含量的检测对比

抗氧化果蔬酵素核黄素液相色谱图见图4。

图4 抗氧化果蔬酵素核黄素液相色谱图Fig.4 Rboflavin liquid chromatogram of antioxidant fruit and vegetable Jiaosu

核黄素的液相色谱图如图4 所示，其保留时间为25.8 min。对照原溶液中核黄素含量为47.9 mg/L，复合抗氧化果蔬酵素中核黄素含量为51.4 mg/L，发酵后核黄素含量提高了7.3%。据研究表明，核黄素为体内黄酶类辅基的组成部分，具有一定的抗氧化活性，当缺乏时会影响机体的生物氧化，使代谢发生障碍，它的作用机理与黄素酶-谷胱甘肽还原酶有关[16]。

2.5 复合抗氧化果蔬酵素原花青素含量的检测对比

原花青素的液相色谱图见图5。

图5 抗氧化果蔬酵素原花青素液相色谱图Fig.5 Procyanidin liquid chromatogram of antioxidant fruit and vegetable Jiaosu

由图5 可知，其保留时间为6.8 min。复合抗氧化果蔬酵素中原花青素含量为1.98×102mg/L，原溶液中的含量为1.82×102mg/L，原花青素含量相比发酵前提高了8.8%。原花青素具有极强的抗氧化活性，自由基的清除活性显著高于维生素C 和维生素E，同时原花青素还具有预防心血管疾病、降“三高”和抗肿瘤的作用。通过鼠李糖乳杆菌的发酵，使果蔬中的原花青素充分提取，有助于提高机体的免疫力，减缓人体的衰老[17]。

2.6 复合抗氧化果蔬酵素抗氧化能力的检测对比

复合抗氧化果蔬酵素抗氧化能力的检测对比见图6、图 7。

图6 抗氧化果蔬酵素清除率曲线Fig.6 Clearance rate curve of antioxidant fruit and vegetable Jiaosu

图7 原溶液清除率曲线Fig.7 Clearance rate curve of raw solution

通过DPPH 抗氧化性试验可得出，复合抗氧化果蔬酵素自由基清除率曲线如图6 所示，IC50值为0.074；原溶液的自由基清除率曲线如图7 所示，其IC50值为0.148。通过对比可得抗氧化果蔬酵素的自由基清除率提高了100%，抗氧化能力显著提高[18]。

3 结论

抗氧化复合果蔬酵素以高生物活性成分的提取为研究目的，研究了酵素发酵阶段菌活、pH 值和总糖的变化特点，得到其发酵时间为40 h～50 h，并通过与发酵前原溶液中的生物活性成分以及抗氧化能力的对比发现，复合果蔬酵素发酵后的天然活性成分如多酚含量提高了29.3%，黄酮提高了38.9%，核黄素含量提高7.3%，原花青素提高8.8%，抗氧化能力提高了100%。该酵素经益生菌转化后，将原料中的天然抗氧化活性成分完整保留并释放，并产生活性代谢产物，参与人体新陈代谢并提高机体的抗氧化能力和免疫水平，清除体内过剩自由基，促进细胞增殖，潜在的调节人体内肠道平衡，促进营养物质的消化和吸收，提高机体免疫力，预防皮肤早衰、延缓衰老等方面具有重要潜能。