玉米粉制备葡萄糖的糖化工艺优化

孟悦，王英哲，田志刚，孙洪蕊，曾宪鹏，杨志强

（吉林省农业科学院，吉林长春130124）

我国是世界上第二大玉米生产国，年产玉米2.15亿吨，除饲料工业每年可消耗大量的玉米外，现在我国已经形成了玉米淀粉、酒精、有机酸、淀粉糖等一系列玉米深加工产品，其中淀粉糖是仅次于酒精的第二大玉米深加工产品[1]。但目前国内生产淀粉糖，原料大都采用淀粉，生产成本高，副产品利用率低，造成资源浪费和环境污染。与复杂的湿法玉米淀粉生产技术相比，玉米粉是将干玉米粒通过机械设备，破损、粉碎、过筛等简单的加工手段而得到一类产品[2]。它资源广、成本低、不受季节的限制，因此利用玉米粉生产葡萄糖是理想的选择[3]。

糖化工艺是影响葡萄糖转化率、葡萄糖质量以及生产周期的关键环节。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端依次水解α-1，4糖苷键，较快速度切下一个个葡萄糖单元，将原料水解成葡萄糖[4]。以玉米粉为原料生产葡萄糖虽然可以降低生产成本，节能节水，但要实现工业化生产也存在诸多技术问题需要解决，玉米经脱胚后，虽然蛋白质和脂肪含量均有所降低，但仍然比玉米淀粉中的蛋白质和脂肪高出许多倍，因此影响了糖化液的物理性质，同时也影响了酶触反应效率。为了提高玉米粉液化液的糖化效率，本研究根据现有的淀粉糖化条件进行了玉米粉糖化条件优化试验，确定了玉米粉糖化最佳条件，制备的糖化液质量好，DX 值高。生产方法简单可行，而且降低成本，减少环境污染，为以玉米粉为原料生产葡萄糖提供了可靠依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米粉：山东省德州市武城县绿源农副产品加工厂，过80 目筛备用，水分质量分数11.84%；无水葡萄糖：西陇科学有限公司；酒石酸钾钠：国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠、硫酸铜、盐酸均为分析纯：北京化工厂；耐高温α-淀粉酶（酶活力70 000 U/mL）、葡萄糖淀粉酶（酶活力110 000 U/mL）：宁夏夏盛实业集团有限公司。

1.2 仪器设备

ME204E 型电子分析天平：德国梅特勒-托利多仪器有限公司；PHS-3C 型精密pH 计：上海雷磁仪器有限公司；WAY-3S 型数字阿贝折射仪：上海仪电科学仪器股份有限公司；HH-ZKYY-5L 型恒温水浴锅：上海科升仪器有限公司；JY10002 型电子秤：良平仪器有限公司；1260Infinity 型高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；蒸发光散射检测器：美国安捷伦公司。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

过筛玉米粉→调浆→液化→调pH 值→加热→糖化→过滤→精制→真空浓缩→葡萄糖浆[5]

1.3.2 玉米粉制备葡萄糖糖化工艺单因素试验

1.3.2.1 糖化温度对糖化液DE值和DX值的影响

玉米粉浆质量分数为25%，经液化后在pH 值为4.3，糖化时间为12 h，葡萄糖淀粉酶添加量为36 U/g时的试验条件下，考察不同糖化温度45、50、55、60、65 ℃对糖化工艺的影响程度，分析不同的糖化温度对DE 值和DX 值的影响，以确定适宜的糖化温度范围[6]

1.3.2.2 糖化时间对糖化液DE值和DX值的影响

玉米粉浆质量分数为25%，经液化后在糖化温度为60 ℃，pH 值为4.3，葡萄糖淀粉酶添加量为36 U/g时的试验条件下，考察糖化时间 2、4、6、8、10、12、14 h对糖化工艺的影响程度，分析不同的糖化时间对DE值和DX 值的影响，以确定适宜的糖化时间范围。

1.3.2.3 pH 值对糖化液DE 值和DX 值的影响

玉米粉浆质量分数为25 %，经液化后在糖化温度为60 ℃，糖化时间为12 h，葡萄糖淀粉酶添加量为36 U/g 时的试验条件下，考察不同pH 值3.3、3.8、4.3、4.8、5.3 对糖化工艺的影响程度，分析不同的pH 值对DE 值和DX 值的影响，以确定适宜的pH 值范围[7]。

1.3.2.4 葡萄糖淀粉酶添加量对糖化液DE 值和DX值的影响

玉米粉浆质量分数为25%，经液化后在糖化温度为60 ℃，糖化时间为12 h，pH 值为4.3 时的试验条件下，考察不同葡萄糖淀粉酶添加量 9、18、27、36、45、54 U/g 对糖化工艺的影响程度，分析不同的葡萄糖淀粉酶添加量对DE 值和DX 值的影响，以确定适宜的葡萄糖淀粉酶添加量范围[8]。

1.3.3 正交试验设计优化糖化工艺参数

根据单因素试验的结果分析，选取糖化温度、糖化时间、pH 值、葡萄糖淀粉酶添加量4 个因素的较优水平范围，以DE 值和DX 值为指标，设计L9（34）正交试验方案，因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.3.4 原料玉米粉水分测定方法

参照GB/T5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》。

1.3.5 DE 值检测方法

DE 值是指糖液中还原糖（以葡萄糖计）占干物质的百分率，以费林试剂法测定样品中还原糖的含量，参照GB/T5009.7-2008《食品安全国家标准食品中还原糖的测定》。

1.3.6 DX 值检测方法

利用高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器检测糖化液中的葡萄糖含量，色谱条件为：Benson800BP-100钙型阳离子色谱柱4.6 mm×250 mm，流动相使用超纯水，氮气为载气，柱温箱设定在80 ℃，进样量10 μL，流速为1 mL/min，将糖化液稀释至一定的质量分数，再经过0.2 μm 膜过滤，收集滤液进行高效液相检测，通过比较标准品与糖化液组分峰的保留时间进行定性分析，利用面积归一法和线性回归方程定量计算DX 值[9]。

葡萄糖标准曲线绘制：制备 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 的标准葡萄糖溶液，按上述液相条件进行检测，得到峰面积。以葡萄糖浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线见图1[10]，计算得线性回归方程为y=2 049.8x+6.192 9，线性相关系数0.999 3，具体样品检测参照GB/T20880-2018《食用葡萄糖》。

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

2 结果与分析

2.1 糖化温度对糖化液DE 值和DX 值的影响

糖化温度对糖化液DE 值和DX 值的影响见图2。

图2 糖化温度对DE 值和DX 值的影响Fig.2 Effect of saccharification temperature on DE value and value DX value

由图2 可以看出，随着糖化温度的不断升高，DE值和DX 值先是增大，到了60 ℃以后开始缓慢下降，这是由于葡萄糖酶活性与温度密切相关，酶制剂和化学催化剂一样随着温度升高，酶解反应速率升高，但酶制剂是一种蛋白质，随着温度过高其活性降低[11-13]，只有温度在60 ℃左右时，是该糖化酶最适作用温度范围。当温度超过60 ℃后，酶活力下降，酶活性被抑制，从而使糖化效果变差。随着糖化温度的不断升高，通过高效液相检测的DX 值在60 ℃时达到了95.21%。说明糖化温度对糖化效果影响较为显著。综合考虑两项指标，糖化温度的适宜温度范围在60 ℃左右。

2.2 糖化时间对糖化液DE值和DX值的影响

糖化时间对糖化液DE 值和DX 值的影响见图3。

图3 糖化时间对DE 值和DX 值的影响Fig.3 Effect of saccharification time on DE value and DX value

由图3 可以看出，随着糖化时间的不断延长，DE值和 DX 值大幅度提高，直到 12 h～16 h 左右，DE 值波动变小，逐渐趋于平稳。且时间再长也无明显的变化，其原因可能是，糖化酶是一种外切酶，从碳链上的非还原性末端依次水解α-1，4 糖苷键，较快速度切下一个个葡萄糖单元，开始时水解进行较快，随着分子链变短，水解强度慢慢减弱[14-15]。DX 值也在12 h 时达到96.41%，表示糖化完全，不必再延长时间，浪费资源。综合考虑两项指标，糖化时间选择在8 h～12 h 为宜。

2.3 pH值对糖化液DE值和DX值的影响

pH 值对糖化液DE 值和DX 值的影响见图4。

图4 pH 值对DE 值和DX 值的影响Fig.4 The effect of pH value on DE value and DX value

由图 4 可以看出，pH 值从 3.3 增大到 4.3 时，DE值和DX 值呈逐渐上升的趋势，并在4.3 时达到了最大值，从4.3 到5.3 时，DE 值呈逐渐下降的趋势。DX值随pH 值的增高呈现了先增大后减小的趋势。由于pH 值对糖化效果影响较大，每种酶都有最适的pH值，过高或过低，都会影响酶分子与底物的结合和催化能力，影响酶的活性[16-17]。综合考虑pH 值选取在4.3～5.3 之间为宜。

2.4 葡萄糖淀粉酶添加量对糖化液DE值和DX值的影响

葡萄糖淀粉酶添加量对糖化液DE 值和DX 值的影响见图5。

图5 酶添加量对DE 值和DX 值的影响Fig.5 The effect of enzymatic dosage on DE value and DX value

由图5 可以看出，葡萄糖淀粉酶添加量对DE 值和 DX 值影响较大，添加量为 9 U/g～36 U/g 时，DE 值从55.97%迅速增大到95.22%，过了36 U/g 后，DE 值开始呈现下降趋势，是因为底物浓度一定时，葡萄糖淀粉酶浓度在添加36 U/g 后达到饱和，继续增加也不会再促进DE 值的升高，如果继续添加淀粉酶，会造成不必要的浪费，增加生产成本[18]。DX 值也在酶添加量的影响下呈现先升高后降低的趋势，与DE 值基本一致。因此选择葡萄糖淀粉酶添加量为27 U/g～45 U/g 为宜。

2.5 正交试验优化糖化工艺参数的结果与分析

在单因素试验的基础上，进行L9（34）正交试验，重点考察糖化温度、糖化时间、pH 值、葡萄糖淀粉酶添加量4 个因素对玉米粉糖化程度的影响，结果见表2，DE值平均值和极差以小写表示，DX 值平均值和极差以大写表示[19]。

表2 正交试验设计与结果Table 2 The design and results of orthogonal experiment

从表2 的极差分析结果可以看出：对糖化DE 值的影响顺序为A＞B＞D＞C，即糖化温度＞糖化时间＞酶添加量＞pH 值，最优组合为A2B3C1D3，即糖化温度60 ℃，糖化时间12 h，pH4.3，酶添加量45 U/g。对DX 值的影响顺序为A＞B＞D＞C，即糖化温度＞糖化时间＞酶添加量＞pH，最优组合为A2B3C3D3，即糖化温度60 ℃，糖化时间 12 h，pH5.3，酶添加量 45 U/g。

正交试验方差分析见表3。

表3 正交试验方差分析Table 3 Analysis of variance for orthogonal

在极差分析的基础上，采用方差分析方法对各因素的显著性进行分析，从表3 中看出，糖化温度对DE值和DX 值的影响达到了显著水平，糖化时间对DE值，酶添加量对DX 值都达到了极显著水平[20]。因此在玉米粉生产葡萄糖糖化液时，糖化温度、糖化时间和糖化酶添加量这3 个因素都要考虑[21-22]。

验证试验：将两组优化参数进行验证试验，在A2B3C1D3条件下 DE 值为 98.86%，DX 值为 97.68%。在A2B3C3D3条件下 DE 值为 98.24 %，DX 值为 98.16 %。在实际生产中，主要是以葡萄糖含量（DX 值）作为主要指标，是直接反应糖化效果好坏的重要参数[23-24]，是葡萄糖得率的重要指标，DX 值高则代表糖化效果越好，葡萄糖得率高[25]，所以最后选择A2B3C3D3即糖化温度60 ℃，糖化时间12 h，pH 值5.3，葡萄糖淀粉酶添加量45 U/g 为糖化工艺的最佳条件。

3 结论

以玉米粉为原料，在葡萄糖淀粉酶的作用下，通过单因素对糖化DE 值和DX 值的影响，根据单因素试验结果设计正交试验进行优化。最佳糖化工艺水平参数：糖化温度60 ℃，糖化时间12 h，糖化pH 5.3，葡萄糖淀粉酶添加量45 U/g。试验制备的玉米粉糖化液质量好，玉米蛋白质絮凝好，固液分层明显，糖液澄清度高，此工艺不仅提高了玉米粉制备葡萄糖的得率，而且为以后的实际生产提供了可靠的理论依据。