响应面优化胡麻粕蛋白提取工艺及其功能性质研究

伊莉，吴锁柱，孟琼宇，张毓，郝林

（山西农业大学食品科学与工程学院，山西太谷030801）

胡麻，又称亚麻，是亚麻科、亚麻属一年生或者多年生的草本植物，在我国许多地区都有种植，如甘肃、新疆、内蒙，宁夏、河北和山西等地区[1]。胡麻籽是胡麻的种子，常用于榨取油脂。胡麻粕则是胡麻籽经过榨油后产生的残渣，一般直接废弃或者作为饲料喂养畜禽，并没有得到有效的利用。

胡麻粕中含有多种成分，其中最主要的成分为胡麻粕蛋白，除此之外还含有一定量的胡麻胶、矿物质、维生素等成分[2-3]。胡麻粕蛋白质含量约为30%～50%[4]，属于麻仁球蛋白，胡麻粕蛋白中氨基酸种类十分丰富，约有18 种，与大豆蛋白相比，胡麻粕蛋白中的精氨酸和谷氨酸等氨基酸含量更高。研究表明，胡麻粕蛋白不仅能增强人体的免疫功能，而且能用于辅助治疗患有烧伤、癌症、肝炎、外伤等营养不良的病人，有很好的研究和应用价值[5]。

目前，植物原料中蛋白质的提取方法主要有碱溶酸沉法，超声辅助法，酶解法等[6-13]。为了进一步提高胡麻粕中蛋白质的提取率，本文以胡麻粕为原料，采用碱溶酸沉的方法提取蛋白，再通过响应面试验优化提取工艺，并对提取得到的蛋白进行功能性质的初步研究，以期对胡麻粕的回收利用和提高胡麻榨油副产品的附加值提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

胡麻粕：山西省农业科学研究院农产品加工研究所；石油醚、氢氧化钠、盐酸、浓硫酸、双氧水均为分析纯：国药集团化学试剂公司；考马斯亮蓝G-250：上海迈坤化工有限公司；牛血清蛋白（bovine albumin，BSA）：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器和设备

78HW-1 型磁力搅拌器：金坛市城东新瑞仪器厂；LXJ-64-01 型离心机：北京医疗仪器厂；DZKW-4 型恒温水浴锅：北京中兴伟业仪器有限公司；S10 型匀浆机：上海市百典仪器有限公司；Q300-B6 型粉碎机：永康市哈瑞工贸有限公司；DER-43 型凯氏定氮仪：上海超越实验设备有限公司；STARTER 3100 型pH 计：HAUS 仪器有限公司；WFJ 2100 型紫外分光光度计：尤尼克仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

胡麻粕筛选拣除杂质后粉碎，过80 目筛，以料液比为1∶3（g/mL）加入石油醚进行脱脂处理，在室温（25 ℃）下用磁力搅拌器搅拌2 h，再静置6 h，弃去上清液。脱脂后的胡麻粕粉石油醚充分挥发后收集备用。

1.3.2 单因素试验

精确称取脱脂后的胡麻粕粉5.0 g，按照不同的料液比加入蒸馏水，搅拌使混合均匀。以1 mol/L NaOH 溶液调节pH 值至一定数值，置于不同温度的恒温水浴中提取一定时间，取出后冷却至室温（25 ℃），4 000 r/min条件下离心20 min，弃去沉淀，上清液以1 mol/L HCl溶液调节pH 值至等电点4.4，静置15 min 沉淀蛋白质，4 000 r/min转速离心10 min，除去上清液，沉淀用蒸馏水洗涤2 次以脱去无机盐等杂质，得到纯度较高的胡麻粕蛋白，计算提取率。各水平的选择详见表1。

表1 单因素试验水平选择Table 1 Factors and levels used in single-factor tests

1.3.3 响应面试验设计

参考单因素试验结果，运用由Box 提出的中心组合设计原理结合响应面优化法，对胡麻粕蛋白提取过程中的料液比、浸提温度、浸提时间、浸提液pH 值4个工艺参数进行优化。

1.3.4 胡麻粕蛋白提取率测定方法

1.3.4.1 胡麻粕中总蛋白质含量的测定

采用微量凯氏定氮法[14]测定粗蛋白中总蛋白质含量。

1.3.4.2 提取粗蛋白中蛋白质含量测定

采用考马斯亮蓝法[14]测定胡麻粕中总蛋白质含量。以牛血清蛋白作为标准物，绘制标准曲线。

1.3.4.3 胡麻粕蛋白提取率计算

计算方法见式（1）。

式中：N 为提取得到的粗蛋白中蛋白质含量，g；M为胡麻粕样品中蛋白质含量，g。

1.3.5 胡麻粕蛋白等电点的测定

蛋白质在溶液中有两性电离的现象。当某一溶液中蛋白质等电点（isoelectric point，pI）=pH 值时，该溶液解离的正负离子数相等，净电荷为0，蛋白质的溶解度最小，这一时刻蛋白质将会最大程度地呈现絮状析出，此时就是蛋白质的等电点[14]。本文测得的胡麻粕蛋白的等电点为4.4。

1.3.6 胡麻粕蛋白功能性质测定

1.3.6.1 持水性测定

称取由最优条件制得的蛋白质0.5 g 与5 mL 蒸馏水置于离心管中，用玻璃棒搅拌均匀，室温（25 ℃）下静置30 min，离心，弃去上清液后称重。按式（2）计算持水性[15]。

1.3.6.2 溶解性的测定

取3 mL 10 mg/mL 胡麻粕蛋白溶液，于4 000 r/min的条件下离心5 min，将离心后所得上清液倒入试管内，用考马斯亮蓝比色法测定其含量。按式（3）计算溶解度[16-17]。

1.3.6.3 乳化性测定

取15 mL 20 mg/mL 的胡麻粕蛋白溶液，用中速匀浆机匀浆30 s 后加入15 mL 花生油并不断混匀，再匀浆1 min 后移入刻度离心管中，在2 700 r/min 转速下离心5 min，取出读取体积。按式（4）计算乳化性[18-19]。

1.3.6.4 起泡性和泡沫稳定性测定

准确称取1.0 g 胡麻粕蛋白，加水配成10 mg/mL 的样品溶液，用转速为10 000 r/min 的匀浆机搅拌1 min后，迅速转入量筒中，测量体积并按式（5）计算起泡能力；泡沫静止20 min 后，再记录体积并按式（6）计算泡沫稳定性[20]。

2 结果与分析

2.1 牛血清蛋白的标准曲线

本试验采用牛血清蛋白为标准品，标准曲线如图1 所示。

图1 牛血清蛋白标准曲线Fig.1 Standard curve of BSA

得到回归方程为y=0.563 3x+0.013 1，R2=0.998 5。式中：x 为牛血清蛋白浓度，mg/mL，y 为吸光度值。线性关系良好。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 浸提温度对胡麻粕蛋白提取率的影响

浸提温度对胡麻粕蛋白提取率的影响如图2所示。

图2 浸提温度对提取效果的影响Fig.2 The effect of temperature on the extraction ratio of protein

从图2 中可观察到，在30 ℃～60 ℃的范围内，随着浸提温度的升高，胡麻粕蛋白提取率呈现出先升高后缓慢下降的趋势，其中，当温度为40 ℃时提取率达到最高值；当温度达到70 ℃时，胡麻粕蛋白提取率出现明显下降，可能的原因是高温使蛋白质变性，影响提取。综合考虑节约能源等因素，胡麻粕蛋白的较适宜浸提温度为40 ℃。

2.2.2 浸提时间对胡麻粕蛋白提取率的影响

浸提时间对胡麻粕蛋白提取率的影响如图3所示。

图3 浸提时间对提取效果的影响Fig.3 The effect of time on the extraction ratio of protein

从图3 中可观察到，时间对胡麻粕蛋白的提取率影响不大，随着时间的延长，胡麻粕蛋白的提取率略微上升，最后趋于平缓。说明随着加热时间的延长，胡麻粕蛋白的析出率变大，但时间过长后，除了使提取时间无效延长之外，还易引起蛋白质变性，而使胡麻粕蛋白提取率下降。综合考虑，胡麻粕蛋白的较适宜浸提时间为60 min。

2.2.3 料液比对胡麻粕蛋白提取率的影响

料液比对胡麻粕蛋白提取率的影响如图4 所示。

从图4 中可观察到，料液比对胡麻粕蛋白的提取效果影响显著，在料液比从 1∶20（g/mL）到 1∶30（g/mL）的过程中，胡麻粕蛋白提取率呈较明显的上升趋势；料液比从 1∶30（g/mL）到 1∶35（g/mL）时，提取率仍缓慢上升；而后继续增大溶液体积，胡麻粕蛋白提取率呈现下降趋势，可能的原因是过大的溶液体积使蛋白质沉淀较困难，使产品得率下降。综合考虑，胡麻粕蛋白提取较适宜的料液比为1∶35（g/mL）。

图4 料液比对提取效果的影响Fig.4 The effect of solid-liquid ratio on the extraction ratio of protein

2.2.4 pH 值对胡麻粕蛋白提取率的影响

料液比对胡麻粕蛋白提取率的影响如图5 所示。

图5 pH 值对提取效果的影响Fig.5 The effect of pH value on the extraction ratio of protein

从图5 中可观察到，pH 值对胡麻粕蛋白的提取率有较显著的影响，在pH 值为8～11 的范围内，随着pH 值升高，胡麻粕蛋白的提取率也随之升高，当pH值大于11 时，因碱性太强就会产生一系列反应，如脱氨，脱羧，肽键断裂等引起胱赖反应，使氨基酸变为有毒物质。且颜色会变深，产生异味，这些因素都不利于对胡麻粕蛋白的提取。综合考虑，胡麻粕蛋白提取较适宜的pH 值为11。

2.3 响应面试验结果分析

2.3.1 响应面Box-Behnken 试验设计与结果

通过对单因素试验结果的分析，可知在考察的4个因素中，对胡麻粕蛋白提取率影响较显著的因素为浸提温度、料液比和pH 值。因此，用Design-Expert8.0.5 软件进行数据处理及回归分析，采用Box-Behnken 方法，以胡麻粕蛋白提取率作为响应值，设计响应面优化试验，考察浸提温度、料液比和pH 值对胡麻粕蛋白提取效果的影响。试验设计方案和试验结果见表2 和表3。

表2 响应面设计试验自变量因素编码及水平表Table 2 The coding and horizontal table of the response surface design experiment

表3 Box-Behnken 试验设计与结果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiment

以浸提温度、料液比和pH 值为关键工艺参数，通过响应面分析法得出回归方程为：胡麻粕蛋白提取率Y=39.94+2.19A-0.044B-0.76C-0.42AB+0.072AC-0.11BC-7.09A2-0.77B2-3.12C2。

为验证模型的有效性，对其进行方差分析，结果如表4 所示。

由表4 可知，回归模型P＜0.000 1，表明模型拟合较好，可靠性强。对胡麻粕蛋白提取率影响极显著的是A 及二次项A2和C2，影响显著的是C；失拟项P=0.515 8，不显著，表明模型与实际情况拟合较好，可用于预测胡麻粕蛋白提取的最佳工艺条件。在所选的各因素水平范围内，由胡麻粕蛋白提取率的二次回归方程可知，各因素影响结果的主次顺序为A＞C＞B，即料液比＞pH 值＞浸提温度。

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.3.2 胡麻粕蛋白提取条件的响应面优化分析

为了进一步研究浸提温度、料液比和pH 值及各因素之间的相互作用对胡麻粕蛋白提取率的影响，运用Design-Expert.8.0.6 软件作出响应曲面如图6 所示。

图6 料液比、浸提温度和浸提液pH 值两两交互的响应面曲线Fig.6 Response surface plots of interactive iffect on the concentration of solid-liquid radio，extraction temperature and pH value

从图6 可以直观看出各因素之间的交互作用对胡麻粕蛋白提取率的影响。图6（a）和（b）响应曲面的坡度较大，说明料液比与浸提pH 值，料液比与浸提温度的交互作用明显，且响应面中有明显的峰值，其中料液比的影响最大。在料液比一定时，随着pH 值的升高，胡麻粕蛋白的提取率先增大，pH 值到达11 后，胡麻粕蛋白的提取率下降。当pH 值一定时，溶液体积增大，胡麻粕蛋白的提取率先增大后减小。当浸提温度保持一定值时，随着溶液体积的增大，胡麻粕蛋白的提取率先明显上升，到达峰值后又下降。当料液比保持一定值时，随温度的增大，胡麻粕蛋白的提取率先趋于平缓，到达60 ℃时，明显下降。图6（c）可以看出浸提温度与浸提的pH 值交互作用不显著，且温度对胡麻粕蛋白的提取率的影响最小，相同的pH 值下，浸提温度改变胡麻粕蛋白的提取率幅度较小。

运用回归方程对胡麻粕蛋白提取的工艺条件进行优化，预测最佳提取工艺条件为：料液比1∶35.77（g/mL），浸提温度39.69 ℃，浸提液pH 值10.88。在此条件下，胡麻粕蛋白提取率的理论值为41.56%。根据实际情况，对工艺条件进行调整，调整后的最佳提取条件为：料液比1∶36（g/mL），浸提温度39.7 ℃，浸提液pH 10.9。在此条件下重复验证试验3 次，得到胡麻粕蛋白实际提取率平均值为41.48%，与理论值基本一致。

2.4 胡麻粕蛋白功能性质的测定结果及分析

试验初步研究了胡麻粕蛋白的功能性质，并与大豆分离蛋白作出比较，结果见表5。

表5 胡麻粕蛋白功能性质检测结果Table 5 The results of property function of flaxseed flake protein%

由表5 可知，胡麻粕分离蛋白比大豆蛋白的持水能力强，蛋白质与水的结合主要取决于其蛋白质结构、氨基酸组成、表面疏水性等因素，胡麻在榨油过程中可能引起了部分蛋白质变性，使亲水基团暴露出来，也可能是胡麻粕蛋白中含有少量多糖，增加了亲水基团，使之更容易与水结合。蛋白质的溶解性是非常重要的功能特性，溶解度数据可以用来确定天然蛋白质的提取，分离和纯化过程，对于蛋白质变性程度也可作为重要指标，蛋白质在饮料中的应用也与其溶解性有很大关系。

胡麻粕蛋白的表面性质（包括乳化性、起泡性和泡沫稳定性）也略优于大豆蛋白，主要是由于胡麻粕蛋白的结构发生变化，使其亲油性，亲脂性基团暴露出来，增强其乳化性能。

3 结论

本试验以胡麻粕为原料，通过单因素试验研究了料液比、浸提温度、pH 值和浸提时间对胡麻粕蛋白提取率的影响；在单因素试验结果的基础上，选取了对胡麻粕蛋白提取影响较大的料液比、浸提温度和pH 值3个因素设计了响应面优化试验，得到胡麻粕蛋白提取的最优工艺条件为：料液比1∶36（g/mL），浸提温度39.7 ℃，浸提液pH 10.9。在此条件下胡麻粕蛋白提取率达到41.48%。对最优工艺条件下提取得到的胡麻粕蛋白进行初步功能性质分析可知，与大豆蛋白相比，胡麻粕蛋白具有更好的溶解性，持水性，乳化性，起泡性和泡沫稳定性，这为胡麻粕蛋白广泛应用于食品生产中奠定了良好的基础。

胡麻籽用于压榨油脂，受到消费者的欢迎，而胡麻粕则一般只能用于畜禽饲料，造成浪费，如果能探索出提取蛋白的最佳工艺条件，将胡麻粕进行回收利用，将会产生广泛的经济效益。