骨伤洗剂微生物限度检查法适用性试验研究

巫繁菁 韦玮 唐林 姚金娥（通讯作者）

（广西骨伤医院药剂科 广西 南宁 530012）

我院骨洗方从上世纪80年代末沿用至今已有近三十年，方含桂枝、荆芥、紫草等七味中药，具有祛风通络、消炎、消肿止痛的功效，用于风湿肿痛、软组织损伤等骨科疾病，属外用制剂，禁内服。根据骨洗方使用特点将骨洗方经水提取而成骨伤洗剂，合约0.55g生药材·ml-1，本文按照2015年版《中国药典》四部的规定[1]对骨伤洗剂进行微生物限度检查法适用性实验研究，结果稳定可行，该方法可用于骨伤洗剂的微生物限度检查。

1.仪器与材料

1.1 仪器

生物安全柜（HR40-ⅡA2，青岛海尔特种电器）、生化培养箱（DNP-9162，上海比朗仪器）、全自动压力灭菌器（LMQ.C-80E，山东新华医疗器械）、电热恒温干燥箱（FY-SY-4，吴江富宇烘箱设备）、电冰箱（LG4-688，广州施乐华）、微波炉（EM-3011EB1，合肥三洋荣事达）、恒温水浴箱（HH-8，常州中捷实验）、电子天平（TP-3102，感量0.1g，赛多利斯）、涡旋振荡器（maxi mixⅡ，Thermo Scientific）、气浴恒温振荡器（ZD-85，金坛市精达）。

1.2 培养基

沙氏葡萄糖液体培养基（批号：150821）、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA，批号1709152）、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基（批号170103）、甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号170509），北京三药科技开发公司提供。胰酪大豆胨液体培养基（TSB，批号20171212），青岛海博生物技术有限公司提供。沙式葡萄糖琼脂培养基（SDA，批号1064381），广东环凯微生物科技有限公司提供。

1.3 供试品

骨伤洗剂（规格：500ml/瓶，批号：20180408，20180409，20180410，广西骨伤医院提供）。

1.4 菌种

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[GDMCC1.220]（中国工业微生物菌种保藏管理中心）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]（中国医学细菌保藏管理中心）、枯草芽孢杆菌（Bacillus Sulticis）[CMCC（B）63501]（广东环凯微生物科技有限公司），白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspeigillus niger）[CMCC（F）98003]（中国食品药品检定研究院）。以上菌种均为第五代。

2.方法与结果

2.1 菌液制备

将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌在33℃的TSB中培养24h，白色念珠菌在25℃的SDB中培养24h，黑曲霉在25℃的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养7d，然后分别用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释成含菌数为1000～10000cfu·ml-1的菌悬液，备用。

2.2 供试液制备

取供试品，混匀，作为供试液。取供试液10ml，加入45℃的TSB至100ml，作为1:10供试液。

2.3 微生物计数法建立及回收率实验

2.3.1 常规法 实验组：吸取5份供试液，每份9.9ml，分别加入0.1ml实验菌液，使含菌量为10～100cfu·ml-1，混匀后吸取1ml置平皿中，倾入TSA，每株实验菌平行制备2个平皿，另从加入真菌的供试液吸取1mL置平皿中，倾入SDA，每株真菌平行制备2个平皿。菌液对照组：取TSB5份，每份9.9ml，分别加入0.1ml实验菌液，摇匀后吸取1ml至平皿中，倾入TSA，每株实验菌平行制备2个平皿，另从加入真菌的TSB吸取1ml置平皿中，倾入SDA，每株真菌平行制备2个平皿。供试品对照组：吸取4份供试液1ml至平皿，2份倾入TSA，2份倾入SDA。稀释剂组：吸取4份TSB1mL至平皿，2份倾入TSA，2份倾入SDA。

回收率计算方法：回收率＝（实验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数）/（菌液组平均菌落数-稀释剂组平均菌落数）

2.3.2 稀释法（1:10） 实验组：取供试液（1:10）进行实验，其余操作同常规法。菌液对照组：操作同常规法。供试品对照组：取供试液（1:10）进行实验，其余操作同常规法。稀释剂组：同常规法。

回收率计算方法：同常规法。

2.3.3 微生物计数法及回收实验结果 由微生物计数法及回收率实验结果可知，需氧菌总数、霉菌和酵母菌的总数测定采用常规法不可行，而采用稀释法回收率均在0.5～2之间，表明稀释法可行，见表1、表2。

表1 霉菌及酵母菌的回收实验比值测定结果

表2 需氧菌的回收实验比值测定结果

2.3.4 稀释法方法验证实验 取供试品按照稀释法（1:10）对需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的计数方法进行验证，3次验证实验结果表明，以稀释法（1:10）进行骨伤洗剂需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数测定，回收率比值均在0.5～2之间，说明供试品无抑菌活性，符合2015年版《中国药典》四部1105非无菌产品微生物限度检查的规定，见表3。

表3 稀释法验证实验结果

2.4 控制菌检查法适用性实验

2.4.1 菌悬液制备 取2.1项下含菌量为1000～10000 cfu·ml-1的金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌菌悬液，用0.9%灭菌氯化钠溶液稀释至含菌数为 10～100 cfu·ml-1的菌悬液，备用。

2.4.2 金黄色葡萄球菌 供试品组：取1:10供试液10ml接种至100ml TSB中，33℃培养24h。阳性对照组：取含菌量为10～100cfu·ml-1的菌液1ml加入100ml TSB中，于33℃培养24h。阴性对照组：取稀释液10ml加入100ml TSB中，于33℃培养24h。取上述培养物分别划线接种于甘露醇氯化钠琼脂平板，33℃培养24～48h。

2.4.3 铜绿假单胞菌 供试品组：取1:10供试液10ml接种至100ml TSB中，33℃培养24h。阳性对照组：取含菌量为10～100cfu·ml-1的菌液1ml加入100ml TSB中，于33℃培养24h。阴性对照组：取稀释液10ml加入100ml TSB中，于33℃培养24h。取上述培养物分别划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂平板，33℃培养24～48h。

2.4.4 控制菌检查验证结果 控制菌检查验证结果见表4。

表4 控制菌检查方法的适用性实验结果

2.5 三批骨伤洗剂的微生物限度检查

根据上述建立的微生物限度检查法，对三批骨伤洗剂进行验证检查，结果均符合《中国药典》规定，结果见表。

表5 三批骨伤洗剂的微生物限度检查结果

3.讨论

骨伤洗剂药物组成中含有挥发性成分的桂枝、荆芥，紫草以及少量的聚山梨酯80和苯甲酸钠，这些成分对金黄色葡萄球菌等有一定的抑制作用[2-6]，常规法实验结果表明骨伤洗剂对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌及枯草麦芽杆菌有一定的抑制作用，所以选择采用稀释法（1:10）来降低和消除减弱骨伤洗剂中的抑菌物质对氧菌、霉菌和酵母菌的抑菌作用，微生物计数法三次验证实验回收值均在0.5～2之间，说明方法可行，可用于骨伤洗剂的微生物限度检查。