利用InDel标记分析23份黄瓜种质的遗传多样性及核心种质资源筛选

张红梅，翟 文，金海军**，丁小涛，余纪柱

（1上海市农业科学院设施园艺研究所，上海市设施园艺技术重点实验室，上海201403；2东华理工大学化学生物与材料科学学院，南昌330013）

黄瓜（Cucumis sativus L.）是世界上重要的蔬菜作物之一，也是遗传研究的一个模式植物［1］。近年来，由于栽培品种遗传背景逐渐狭窄，品种间的遗传多态性远远低于同属的甜瓜［2］。利用多态性丰富的种质资源，拓展黄瓜作物的遗传多样性对黄瓜遗传育种及生产有着十分重要的意义。传统的育种方法很难满足黄瓜遗传改良发展的需求，目前分子标记是进行黄瓜种质遗传多样性及亲缘关系分析的有效工具［3］。RAPD、AFLP、SSR［4-6］等现代分子标记技术已经在黄瓜遗传育种中得到了应用。核心种质库能够以最小的种质资源数目，最大程度地代表资源总体的遗传变异，可大幅减少资源研究的人力和物力，是研究物种遗传多样性和人工驯化的理想材料［7-8］。构建核心种质库的方法有聚类法、抽样法、最大化法（Maximum strategy，M策略）等［5］。M策略能够最大限度地保留等位基因数目，即选择具有高丰度等位基因且低遗传冗余的材料［9-10］。采用M策略预测核心种质的最佳抽样比例，目前已在水稻［11］、苹果［9］、咖啡［10］等作物中广泛应用。

基于全基因组重测序开发的InDel（Insertion-deletion）插入缺失标记与其他标记反映的基因组信息不同，具有分布广、多态性强、密度高、变异稳定等优点［12］，在黄瓜种质资源遗传多样性的评价［13］、品种纯度［14］、亲缘关系鉴定［13］、核心种质资源构建［15］、遗传图谱的构建、苦味［16］和白粉病［17］等重要性状定位以及分子育种上都有重要的应用价值。本研究拟应用分布于黄瓜7条染色体上的InDel标记，在23份有代表性的黄瓜种质中分析其遗传多样性，结合表型特点构建核心种质库，以期为黄瓜种质资源的鉴定和利用提供有力工具。

1 材料与方法

1.1 供试材料

挑选23份不同地理来源的黄瓜自交系种质为研究材料，其中有13个来自亚洲（日本、韩国和中国），8个来自欧洲、2个（加工型黄瓜）来自美国，其性状特点如表1所示。所有材料均由上海市农业科学院设施园艺研究所收集。

表1 23个黄瓜种质的性状特点Table1 Morphological characteristics of 23 cucumber germplasms

1.2 试验方法

1.2.1 23个黄瓜种质的表型性状鉴定

2016年2月26日，将23个黄瓜种质各分别播种30个单株，在苗期调查白粉病和霜霉病的病情指数，在结果期调查商品瓜的瓜形、瓜长、瓜直径、瓜色、瓜刺颜色，测量结果取平均值。白粉病和霜霉病发病率的调查方法是分别用含量为1×105个/mL和5 000—7 000个/mL的悬浮孢子液，在湿度80%、白天26℃/夜晚18℃环境下分别接种黄瓜幼苗叶片，将发病级别分为0—5级，计算病情指数［18-19］。

1.2.2 InDel标记分析

在黄瓜生长的幼苗期取叶片，混合取样。试验材料基因组DNA提取采用CTAB法［20］。PCR反应体系为20μL，其中DNA模板50 ng，10×Buffer 2μL，Mg2+1.25 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，上游引物（10μmol/L）0.5μL，下游引物0.4μmol/L，Taq酶1.2 U，ddH2O补足至20μL。PCR反应程序为：94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，33个循环；72℃7min；4℃保存。使用8%（W/V）聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电压150 V，电泳时间45 min。银染显色后照相保存。

1.2.3 数据分析

应用NTSYS-pc2.1软件中的SAHN程序计算相似性系数，用UPGMA方法绘制聚类图，主成分分析应用软件中的Decenter和Eigen模块并绘图，应用Structure 2.3.4软件［21］进行群体遗传结构分析，混合模型群体数目（K值）设置为2—8，对每个K值对应的Var［ln P（D）］值的标准差进行计算，MCMC（Markov Chain Monte Carlo）设置10万次迭代，初始burn-in次数为10万，基于数学模型确定群体分组，并计算个体相应的Q值。应用Mstrat软件［22］，用M（M method）和R（Random）两种方法预测核心种质最佳样本，设置参数为20次重复（Replicates），每次重复20次迭代次数（Maximum iterations），每次递增1个样本（Step）数。

2 结果与分析

2.1 InDel分子标记

挑选均匀分布于基因组的93对InDel引物［22］，对23份有代表性的黄瓜种质进行扩增，筛选到66对InDel引物（表2）有多态性且有较清晰的目标产物，多态性比率为71%。经统计，这66对引物共获得121个多态性位点，说明这批InDel标记基因组的覆盖度高，而且多态性强，能够较好地应用于黄瓜遗传多样性分析。

表2 InDel标记在黄瓜基因组中的分布Table 2 Distribution of InDelmarkers in cucumber genome

2.2 23份黄瓜种质的遗传多样性分析

对23份黄瓜种质的遗传相似性系数进行统计发现，相似性系数在0.23—0.95，平均值为0.56，主要分布在0.3—0.4区间和0.7—0.8区间内，分别占总数的24.1%和24.9%。遗传相似性系数低于0.6的有137对组合，占全部组合的比率是54%，说明这些材料的遗传多样性较好。

将23份黄瓜种质进行聚类分析表明（图1），在遗传相似性系数0.61处，23份材料分为三大类群，P1有12个种质，主要来源于亚洲，包括北京、上海、辽宁、日本和韩国；P2有10个种质，大多来自欧洲，还包含美国加工型黄瓜；来源于广东的14号种质被单独地分到P3，是来自南方的种质，商品瓜表现为短棒形、白刺、抗白粉病和霜霉病。

应用主成分分析方法（PCA）对23个黄瓜种质的亲缘关系进行分析，第一、第二主成分贡献率分别为41%和35%，累计贡献率为75%，能反应23个变量的主要信息。绘制PCA的2D聚类图可以看出，P1与P2、P3被明显地分开，说明它们的亲缘关系较远。P1中来源于亚洲的材料遗传多样性较丰富，如7号、8号来自上海的种质与这个亚群中其他种质遗传差异较大（图2）。P3的亲缘关系在P1和P2之间，更接近P1（图2）。

图1 23份黄瓜种质的UPGMA聚类分析Fig.1 UPGMA cluster analysis of 23 cucumber germp lasm s

图2 23份黄瓜种质的PCA分析Fig.2 PCA analysis of 23 cucumber germ p lasm s

遗传结构分析结果显示：K值为3时得到最佳分组。如图3所示，该结果与聚类和主成分分析得到的结果一致，P3遗传结构中有42.9%的遗传成分与P1相似，P2（欧美种质）和P1（亚洲种质）这两个亚群之间遗传差异明显，基因交流较少。总的来说，3个遗传多样性分类分析方法的结果大致相同。

图3 23份黄瓜种质遗传结构分析的3个亚群Fig.3 Three subgroups of genetic structure analysis of 23 cucumber germplasms

2.3 基于M 策略构建黄瓜核心种质资源库

利用InDel标记分析的结果，对核心种质最佳样本量进行预测，并构建黄瓜的核心种质库。将23份黄瓜种质的基因数据输入Mstrat软件，先模拟核心种质库不同取样大小时等位基因的覆盖度。如图4所示，M方法和R方法分析得到结果基本一致，当取样群体为1—5时，所包含的等位基因数呈指数级增长，到5时即可涵盖约230个基因，为黄瓜遗传变异的87%；此后增幅减缓，并在取样量为9时接近阈值，因此将核心种质库的群体大小确定为9。建库过程重复20次，将各种质资源按在上述模拟结果中出现的次数排序，选取出现次数较多的9份种质构成黄瓜核心种质库，包含材料编号为2、14、3、6、7、17、22、9、13。

图4 黄瓜核心种质库大小模拟Fig.4 Simulating the size of cucumber core germplasm bank

3 结论与讨论

针对黄瓜栽培种遗传基础狭窄、遗传多样性较低等问题，目前较为有效的方法是利用分子标记进行种质资源的遗传分析。王佳等［23］利用ISSR分子标记对黄瓜种质资源进行了多态性检测，虽不能按照生态型将现有黄瓜种质资源完全聚类，但总体而言，可以将其分为雌性型和普通型两大类。李锡香等［24］利用RAPD技术对黄瓜种质资源进行了鉴定与分类，聚类分析结果能将不同来源国的种质较好地区分，但并不能很好地区分中国种质来源地不同的生态类型。李翔等［25］利用EST-SSR标记对39份云南地方黄瓜材料进行遗传多样性和亲缘关系分析，发现云南地方黄瓜种质资源多样性较丰富，聚类分析和主坐标分析所获结果基本一致，为云南黄瓜种质资源保存与利用提供了依据。

随着高通量测序技术的发展，InDel标记作为一种高通量遗传标记，具有分布广、重复性好、检测方便、呈共显性遗传等优点，被广泛用于植物遗传多样性分析、高密度遗传图谱构建、基因定位、种子纯度鉴定和分子标记辅助育种等研究领域［5］。在水稻遗传育种中，相比于RAPD、RFLP等传统分子标记，InDel标记技术在水稻籼粳属性鉴定中准确率高，且快捷简便［26］。张圣平等［16］研究获得的InDel标记与Bt紧密相连，遗传距离为0.8 cM，可应用于黄瓜果实无苦味MAS育种。兰青阔等［14］基于InDel标记用焦磷酸测序技术对种子纯度进行了鉴定，提高了鉴定的准确性和稳定性，并且更加高通量和自动化。本研究应用基于黄瓜重测序开发的InDel标记，分析了23份黄瓜种质的遗传多样性，UPGMA进化树聚类方法、主成分分析和群体遗传分析结果大致相同，将其分为三大类群。P1来源于亚洲，都是华南类型黄瓜。P2来源于欧洲和美国，大部分属于欧洲类型黄瓜，包含欧洲长黄瓜和欧洲短黄瓜，但22号和23号是两个加工型黄瓜，从表型看应属于华南类型，但从亲缘关系上与欧洲类型更为接近，说明其遗传背景具有欧洲类型黄瓜基因。P3包含1个来源于广东的种质，从表型看属于华南类型，从亲缘关系看更接近P1，但与P1的亲缘关系有一定的差距，说明其遗传基础比较丰富，遗传背景复杂。P1和P2分别属于华南类型和欧洲类型，所以遗传差异明显。研究结果很好地反映了黄瓜种质间的形态相似性和地理区域的差异。

核心种质是以最少的种质样品来最大程度地代表一个物种种质资源的遗传多样性，以方便种质资源的保存、管理及进一步的评价、利用。为了能够获得黄瓜核心种质的样本量，研究者利用多种方法来构建核心种质资源库。郭大龙等［27］应用M策略、遗传距离法和Core hunter法构建葡萄的核心种质资源，M策略构建的核心种质能保留核心种质全部的等位基因。邓学斌等［28］应用5种不同的方法（Mstrat、Random、REMC、SBS和SFS）构建了番茄10种初始核心种质资源，发现Mstrat是构建加工番茄亚群核心种质的最佳方法。Random随机抽样法得到的核心种质虽能有效保留原始种质的遗传结构，但等位基因代表性较差［29］；REMC、SBS和SFS方法虽可100%覆盖等位基因，但其核心群体结构代表性却较差［30-31］。采用Mstrat方法构建遗传背景狭窄的加工番茄亚群的核心种质，兼顾了群体结构和等位基因覆盖度［11］。本研究利用InDel标记分析的结果，应用M策略将9份黄瓜种质确定为核心种质，能够最大程度地覆盖群体的等位基因。除此之外，进行核心种质构建时也加入了表型数据评价，各种质在表型上的多样性也是建库质量评价的重要指标，这9份核心种质包含了华南类型和欧洲类型，白刺、褐刺以及光滑无刺型，欧洲类型长黄瓜、欧洲类型短黄瓜以及加工黄瓜等，所以本研究构建的9份核心种质能够很大范围地覆盖基因型和表型的变异。本研究所使用的试验材料是经过多代纯化形成的遗传多样性丰富和遗传稳定的黄瓜自交系，更有利于核心种质在科研和育种中的直接利用。