7个箭筈豌豆品种生育期、产量与SSR遗传多样性比较

陈柳倩，路 璐，罗 璇，江 舟，魏臻武，赵文明，陈国宏，徐 琪

（扬州大学动物科学与技术学院，扬州225009）

为更好地实施“藏粮于地、藏粮于技”战略，华东地区多处稻-麦田块采用轮作休耕制度，复种绿肥，以促进生态环境改善和资源永续利用。箭筈豌豆（Vicia sativa L.）是野豌豆属（Vicia）重要的绿肥之一，不仅能够显著提高耕地中有机质含量，还能增加土壤微生物含量和活性，改善各项理化性质，调节土壤养分库。根据中国数字植物标本馆（http：//www.cvh.org.cn/cms/）和宋敏等［1］的统计结果，野豌豆属植物广布于我国各省，其中栽培种5种，野生种36种。不同品种的箭筈豌豆生育期和农艺性状差异明显，杨红燕［2］研究发现，不同品种箭筈豌豆（‘苏箭4号’‘西牧333’‘淮箭1号’）进入花期时间不同，‘苏箭4号’进入花期最早。

微卫星又称简单重复序列（SSRs），一般为短的重复序列（1—6 bp）组成的串联DNA序列，是继RFLP、RAPD等分子标记后出现的第二代分子标记技术［3］。随着分子生物学的发展，微卫星标记技术越来越广泛地应用于植物遗传多样性研究中。Liu等［4］通过转录组测序，获得了1 071条潜在的EST-SSR标记。国外也有学者利用SSR技术分析了窄叶野豌豆和苕子的多样性，发现这2种箭筈豌豆具有较高的遗传多样性，多态信息含量（PIC）达到了0.5以上［5-6］。

箭筈豌豆品种众多，遗传多样性也较丰富，不同品种间农艺性状差异较大，生产中普遍存在品种杂乱、利用价值难以得到充分发挥的问题。因此，加强箭筈豌豆品种资源研究、筛选优良品种，是发展绿肥生产的基础和当务之急。本研究以生产中常见的7个箭筈豌豆品种为试验材料，比较不同品种的生育期和鲜草产量，并利用微卫星标记评价鉴定这7个品种的遗传多样性以及亲缘关系，旨在筛选优质种质资源，为本地区发展冬季休耕绿肥生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验在扬州大学草业科学试验基地进行，地处江苏省中部，位于长江北岸、江淮平原南端，为亚热带季风性湿润气候向温带季风气候的过渡区。该地区年降水量864 mm，平均气温15.8℃，无霜期138 d。试验地土壤为轻壤土，容重1.48 g/cm3，土壤有机质14.58 g/kg，pH 8.46，全氮0.821 g/kg，速效钾57 mg/kg，有效磷5.36 mg/kg。本研究所用材料均为该地区使用较为广泛的箭筈豌豆品种（‘兰箭1号’‘兰箭2号’‘兰箭3号’‘青箭’‘贵苕’‘连苕’和‘镇江野豌豆’），均由扬州大学草业科学魏臻武教授实验室提供。

1.2 生育期和鲜草产量测定

供试7个箭筈豌豆品种于2018年9月20日播种，每个品种种植2个小区，共14个小区，记录生育进程（出苗期、分枝期、现蕾期、盛花期和结荚期）。盛花期后，采用样方取样，样方面积为1 m2（1 m×1 m），每个小区取3个样方，取样后称鲜草质量，并折算为公顷产量。

1.3 SSR分型分析

1.3.1 基因组DNA提取

每个品种随机选取混合种子20份，取种子约200 mg，加入液氮充分研磨后将粉末转移至裂解液中，于60℃水浴20—30 min，期间上下混匀3—5次，加入苯酚-氯仿（1∶1）抽提，去除种子中淀粉等大分子物质，离心吸取上层水相，具体方法按照试剂盒（TIANGEN，北京）说明书进行。NanoDrop ND-1000浓度测定仪测定DNA质量浓度并稀释至50 ng/μL，于4℃保存。

1.3.2 SSR引物设计及筛选

参照文献［4］，选取10对具有代表性的引物（表1），由南京擎科生物科技有限公司合成。将7个箭筈豌豆品种的基因组DNA分别混合后进行PCR扩增，扩增结果通过琼脂糖凝胶电泳进行确认，选取扩增片段呈多态、片段长度在100—500 bp且条带清晰的引物加入FAM荧光标记修饰进行后续试验。

表1 SSR引物序列Table 1 The primers of SSR in the experiment

1.3.3 SSR片段扩增与分型

以7个箭筈豌豆品种的20个样本DNA为模板，分别与筛选出的引物进行PCR扩增，优化后的PCR程序为：94℃预变性3 min；94℃变性35 s，53—56℃退火35 s，72℃延伸13 s，35个循环；72℃延伸7 min，扩增产物以ABI 3730XL DNA全自动基因分析仪为平台，以GeneScan-500为标准，进行荧光-多重PCR检测。

1.4 统计分析

试验采用Excel 2003建立数据库，利用Microsatellite-Toolkit统计各微卫星位点的等位基因数（Na）、有效等位基因数（Exp Ne）、杂合度（Ho、He）和多态信息含量（PIC）；并采用UPGMA聚类方法，以遗传距离为依据构建分析7个箭筈豌豆品种间的遗传关系。

2 结果与分析

2.1 不同品种箭筈豌豆生育期和鲜草产量的比较

由图1可以看出，除‘青箭’生育期长达229 d外，其他6个箭筈豌豆品种的生育期均为175 d左右，主要差异在现蕾期和盛花期。从鲜草产量来看（图2），‘兰箭1号’‘兰箭2号’‘兰箭3号’‘青箭’‘贵苕’均超过了250 t/hm2。

图1 不同品种箭筈豌豆生育期的比较Fig.1 Com parison of grow th period of different Vicia sativa L.varieties

图2 不同品种箭筈豌豆鲜草产量的比较Fig.2 Com parison of fresh grass yield of different Vicia sativa L.varieties

2.2 不同品种箭筈豌豆遗传多样性分析

不同箭筈豌豆品种荧光-多重PCR检测结果表明，选取的扩增片段具有多态性（图3）。由表2可知，7个箭筈豌豆品种等位基因数均较为丰富，其中‘连苕’多达30种；‘兰箭3号’‘镇江野豌豆’与‘连苕’的PIC分别为0.427、0.377和0.313，其余4个品种呈现低度多态（PIC＜0.25）；‘兰箭3号’群体杂合度也较高（He＞0.5）。

图3 荧光-多重PCR检测结果Fig.3 Results of fluorescent-multip lex PCR

表2 7个箭筈豌豆品种遗传多样性参数Table 2 Genetic diversity parameters of 7 Vicia sativa L.varieties

2.3 不同箭筈豌豆品种聚类分析

采用UPGMA聚类方法，基于品种间的遗传距离，构建不同品种的系统发生树。如图4所示，7个品种分为两个类群，‘连苕’‘镇江野豌豆’和‘青箭’聚为一类；‘兰箭1号’‘兰箭2号’‘贵苕’和‘兰箭3号’聚为一类。

3 讨论

不同绿肥作物在相同生长条件下，其生长特性、最适宜翻压时期并不同。本试验研究了7个箭筈豌豆品种的生育进程和鲜草产量，结果表明：在本试验条件下，除‘青箭’生育期较长外，其他6个箭筈豌豆品种的生育期均为175 d左右。由于‘青箭’现蕾期和盛花期时间较长，势必延长种植‘青箭’适宜翻压时期，影响下一季水稻种植，因此‘青箭’不适宜本地区推广种植。绿肥生物量越多，翻埋后越有利于培肥地力［7］。从鲜草产量来看，‘兰箭1号’‘兰箭2号’‘兰箭3号’‘青箭’‘贵苕’均超过了250 t/hm2。前人研究表明，春箭筈豌豆5-1-5品系苗期生长缓慢，鲜草产量只有114.7 t/hm2［8］，‘陇箭1号’两年平均产量只有96.6 t/hm2，可见‘兰箭3号’等几个品种具有较高的生物量，意味着翻耕后具有较好的培肥地力。

遗传多样性分析表明，7个箭筈豌豆品种均检测出较多的等位基因数。但从PIC来看，仅有‘兰箭3号’‘连苕’与‘镇江野豌豆’为中度多态的品种（0.25＜PIC＜1.00），其余4个品种呈现低度多态（PIC＜0.25），表明野豌豆属不同品种的PIC存在一定差异，当然也不排除是由于检测引物不同所致。‘兰箭3号’群体He较高（＞0.5），说明该品种具有丰富的遗传多样性。研究还发现，‘兰箭1号’‘兰箭2号’‘兰箭3号’和‘贵苕’聚为一类。

综上，‘兰箭3号’具有合适的生育期、较高的产量和遗传多样性，可作为本地区冬季休耕绿肥生产的理想品种。

图4 基于遗传距离构建的7个箭筈豌豆品种聚类图Fig.4 Clustering diagram of 7 Vicia sativa L.varieties based on genetic distance