清肝明目丸抗炎抗菌作用研究*

石敏娟，何侃亮，李 博，甘雪峰，袁秋贞，任 啸，宋 瑞，李 芳，王卫峰，姜姗姗△

1.陕西省中医医院(西安 710003)；2.西电集团医院(西安 710077)；3.陕西省中医药研究院(西安 710003)

角膜炎是眼科常见病，属中医“聚星障”、“花翳白陷” 范畴，其致盲率和复发率居角膜病变的首位。西医常以抗菌治疗为主 ,但由于药物毒副作用和细菌耐药的产生，临床疗效受到一定影响。近年来中医药在治疗此类疾病方面取得了较好的效果，清肝明目丸由板蓝根、谷精草、木贼等15位药材加工制成，具有清肝泻火，明目退翳的功效。其在临床中已使用多年，在治疗肝火上炎引起的目赤肿痛，眼生星翳，畏光流泪等方面有很好疗效，为进一步明确该制剂的药效机制，以及为临床使用提供理论和实验数据，本研究进行了清肝明目丸抗炎及抗菌方面的实验研究。

材料和方法

1 材 料

1.1 实验动物：昆明种小鼠，雌雄各半，体重(18～22 g)，购于西安交通大学医学院实验动物中心，许可证号：SCXK(陕)2007-001。

1.2 实验药物：清肝明目丸 (陕西省中医医院制剂室，20140812)；阿司匹林肠溶缓释片，(国药准字 H20030396，产品批号1407253，规格：50 mg/片)。实验时用蒸馏水配制成2 mg/ml的混悬液，4℃冰箱储存备用；生理盐水。菌种：乙型溶血性链球菌(CMCC32210)、大肠埃希氏菌(ATCC25922)、福氏志贺氏菌 (CMCC51573)、金黄色葡萄球菌(ATCC25925)、绿脓假单胞菌(ATCC57853)、白色假丝酵母菌(CMCC85021)。以上菌株从西安交通大学医学院引进。

1.3 实验仪器和试剂：AL104型电子天平METTLER TOLEDO公司； LXJ-Ⅱ型离心沉淀机(上海医用分析仪器厂)；721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；SYQ-DSX-280B型手提式不锈钢蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；101型电热鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司)；303型电热恒温培养箱(北京科伟永鑫实验仪器设备厂)；SW-CJ-2D型双人净化工作台(苏州净化设备有限公司)；H2Q-X100型恒温摇床(太仓市实验仪器设备厂)；麦氏比浊管(温州康泰生物科技有限责任公司)。打孔器；冰醋酸、二甲苯均为分析纯。

2 研究方法

2.1 清肝明目丸对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响：昆明种小鼠50只，雌雄各半，体重18～22 g，随机分为5组，每组10只。模型组阿司匹林(200 mg/kg)，清肝明目丸低剂量组(0.6 g/kg)、中剂量组(1.2 g/kg)、高剂量组(2.4 g/kg)，每组动物以20 ml/kg,连续灌胃5 d，1次/d，模型组动物灌胃同体积生理盐水。末次给药后45 min给每只小鼠右耳两侧均匀涂抹二甲苯20μl，致炎20 min后，将小鼠脱颈处死，顺着耳廓基线剪下双耳，在左右耳同一部位用7 mm打孔器打孔，分别称重，计算左右两个耳片的质量差即为肿胀度，同时计算各组肿胀抑制率，肿胀抑制率(%)=(模型组平均肿胀度-给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度×100%。

2.2 清肝明目丸对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响:50只昆明种小鼠，分组同2.1项给药，末次给药45 min后尾静脉注射0.5%伊文斯蓝0.01 ml/10g，后即刻0.7%冰醋酸(0.2 ml/只)腹腔注射，20 min后将小鼠脱椎处死，剪开腹部皮肤用6 ml生理盐水分数次冲洗，吸出洗涤液，合并后加生理盐水，稀释至10 ml，混匀，3000 r/min,离心15 min，再取上清液于590 nm处测光密度(OD)值，并计算各组抑制率，抑制率(%)=(模型组平均OD值-给药组平均OD值)/模型组平均OD值×100%。

3 体外抗菌实验

菌液制备：将大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、白色假丝酵母菌接种于2 ml的MH肉汤培养基中，乙型溶血性链球菌接种于血清MH肉汤培养基中，37℃培养6 h后，用标准麦氏比浊管调整菌液浓度至0.5麦氏单(1.5×108cfu/ml)的实验菌液，再用无菌肉汤稀释150倍，得浓度1×106cfu/ml菌液，入4 ℃冰箱保存备用。药液制备：准确称取清肝明目丸20 g，加去离子水200 ml，浸泡溶解后，常规煎煮30 min，8层纱布过滤药液，药渣再加水100 ml，同法煎煮30 min，合并两次滤液，离心去渣，水浴浓缩成20 ml，即成1 g/ml清肝明目丸，调pH7.2～7.4，115℃，20 min高压灭菌后置冰箱保存备用。

配制好的清肝明目药液先用MH肉汤倍比稀释，取1 ml不同浓度的稀释药液，分别加入106cfu/ml大肠埃希氏菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、绿脓假单胞菌、白色假丝酵母菌0.1 ml,乙型溶血性链球菌每管各加羊血1滴，最终接种细菌量每管105cfu/ml。同时设阴性对照管(加入药液0.1 ml，不加细菌)和阳性对照管(加入细菌0.1 ml，不加药液)。37℃培养24 h，肉眼观察，与阴性对照管和阳性对照管进行比较，不发生混浊变化的最高药物稀释倍数即药物最小抑菌浓度(MIC)。将未见细菌生长管中液体0.1 ml接种到琼脂培养基平板上(乙型溶血性链球菌接种血琼脂培养基平板)，置37℃温箱继续培养24 h，将含有≤5个菌落数的琼脂平皿中药物浓度判为最低杀菌浓度(MBC)。

4 体内抗菌实验

感染菌液的制备：根据体外抗菌试验结果，选择金黄色葡萄球菌进行体内抗菌试验。在2 ml营养肉汤中接种金黄色葡萄球菌，于37℃培养8 h后，取1 ml转种于100 ml营养肉汤中，37℃震荡培养18 h，721型分光光度计在600 nm波长处比色，同时取0.1 ml做细菌计数。菌液3000 r/min，离心10 min后,取沉淀用5%胃膜素依次稀释为10-1,10-2,10-3等不同浓度菌液。以能引起小鼠腹腔注射菌液( 0.5 ml/只) 48 h内，引起90%动物死亡的浓度作为体内实验浓度，经预实验确定为 1.45×109cfu/m。

取昆明小鼠70只，雌雄各半，体重18-22 g，随机分为5组，每组14只。模型按照“2.1”项下方法分组给药，连续5 d，第5天给药后1 h分别腹腔注射5%胃膜素稀释的金黄色葡萄球菌菌液(约1.45×109/ml)，0.5 ml/只，观察小鼠在2 d内存活情况，记录死亡时间，统计各组小鼠死亡数，计算死亡保护率。死亡保护率( % )=( 模型组死亡率-实验组死亡率) /模型组死亡率×100% 。

5 统计学方法 实验数据采用SPSS 13.0进行单因素方差分析，结果用均数±标准差表示，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 清肝明目丸对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 见表1。造模20 min后小鼠耳廓肿胀明显。清肝明目丸中、高剂量组耳片肿胀明显减轻，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。说明清肝明目丸对二甲苯所致小鼠耳肿胀有一定的抑制作用。

2 清肝明目丸对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 见表2。清肝明目丸高剂量组腹腔通透性OD值明显低于模型组，组间差异有统计学意义(P<0.05)。提示清肝明目丸对0.7%冰醋酸致小鼠腹腔通透性增加有抑制作用。

表1 清肝明目丸对二甲苯所致小鼠耳肿的影响

注：与模型组比较,*P<0.05；△P<0.01

表2 清肝明目丸对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响

注：与模型组比较,*P<0.05；△P<0.01

3 体外抗菌实验研究 见表3。清肝明目丸对金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌及白色假丝酵母菌均有不同程度的抗菌作用，其抗菌效果依次为：金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌>白色假丝酵母菌>铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌。其对金黄色葡萄球菌的作用最强，MIC为7.81 mg/ml，MBC为15.63 mg/ml。

表3 清肝明目丸体外最低抑菌浓度和最低杀菌浓度(mg/ml)

4 体内抗菌实验 见表4。模型组小鼠感染金黄色葡萄球菌后，活动差，饮食喝水减少，48 h死亡率为92.9%，与模型组比较，清肝明目丸2.4 g/kg及1.2 g/kg剂量能明显降低金黄色葡萄球菌感染所致试验小鼠的死亡率，即清肝明目丸对金黄色葡萄球菌致死小鼠具有明显的保护作用。

表4 清肝明目丸的体内抗菌作用

注：与模型组比较,*P<0.05；△P<0.01

讨 论

外障眼病是眼科临床常见病，多发病，易复发[1]。外障是指发生在胞睑、两眦、白睛、黑睛的眼病，多因六淫之邪外袭或外伤所致，亦可由肝肾阴虚、虚火上炎等引起，又称“聚星障”或“花翳白陷”[2]。其病变部位包括结膜、角膜、巩膜、泪器、泪膜，证候特点为起病急、发展快、自觉症状明显、外观症状显露， 如红赤肿胀、潮湿糜烂、生眵流泪、溃脓结痂等，其临床症状表现类似于西医中的角膜炎。刘卫华等[3]总结了大量中医文献，得出热、风、虚、瘀为角膜炎发病重要病机，而肝经热毒、肝风热极常易导致角膜炎发生。在中医学理论中角膜为黑睛，属五轮学说之风轮，黑睛在脏属肝，肝与胆相表里，故黑睛疾病常与肝胆相关，同时黑睛病位浅表，导致黑睛生翳赤痛之证尤以风、火、湿为主，治法常用清热解毒，疏风泻火，清肝利胆之法[4-5]。

现在医学对此类疾病的治疗主要以抗菌药物或激素类药物进行抗菌消炎[1]。中医认为“肝开窍于目” “肝藏血，目得血而能视”，且肝经行走于目系,故在眼部疾病治疗上应着清肝、滋阴、养血之法 。清肝明目丸以板蓝根清热解毒；谷精草、木贼明目退翳，青葙子、蝉脱、白蒺藜加强清肝明目退翳作用；紫草、赤芍、玄参清热凉血，散瘀止痛；柴胡疏肝解郁并助散邪解毒；生地滋阴养血，使瘀去而正不伤；黄芪、白术补气扶正固本；诸药合用，有清肝泻火、明目退翳、扶正固本之功效。

本研究以二甲苯致小鼠耳肿胀、冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性为模型，对清肝明目丸的抗炎作用进行评价。结果表明，清肝明目丸可明显抑制二甲苯致小鼠耳肿胀和冰醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增加，其作用与剂量有一定的依赖关系。

根据感染的病原菌，可将感染性角膜炎分为细菌性角膜炎和真菌性角膜炎，以细菌性角膜炎更为常见[6]。细菌性角膜炎属眼科常见疾病，是主要致盲的眼科疾病。不同年龄患者均可发病，如果在发病早期得不到及时有效的治疗，极易引起角膜溃疡穿孔、眼球发炎等[7]。细菌性角膜炎病原菌以革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性杆菌为主[8]。常见致病菌包括链球菌科、细球菌科(细球菌、葡萄球菌)、肠杆菌科(肠杆菌、沙雷菌、变形杆菌属等)和假单胞菌科[9]。常见的致病菌中，以表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌引起的细菌性角膜溃疡最为多见[10]。有研究从87例感染性角膜炎患者标本中分离到28株病原菌，其中阳性球菌占53.5%，阴性杆菌占32.1%，病原菌主要以葡萄球菌属和大肠埃希菌为主[11]。2856份角膜炎患者眼部分泌物细菌培养阳性560例，阳性率为 19.61%，革兰阳性球菌占53.75%，包括表皮葡萄球菌、链球菌、微球菌；革兰阴性杆菌占26.43%，包括铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、沙雷菌[12]。现在对感染性角膜炎，临床多以抗菌药物治疗为主，虽能改善症状，但近年来由于抗菌药物的滥用，病原菌产生了较高耐药率[13]。体外抗菌试验表明，清肝明目丸对于多种细菌具有明显抑菌及杀灭作用，其抗菌效果依次为：金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌>白色假丝酵母菌>铜绿假单胞菌、大肠埃希氏菌，且有较好保护金黄色葡萄球菌感染小鼠的作用。综上所述，清肝明目丸对角膜炎患者具有一定的抗炎和抗菌作用。