荷叶茶制作工艺与正交试验法优选荷叶茶浸提工艺分析*

陈秋香， 刘 静

1.长沙市中医院(长沙市第八医院)(长沙 410100)；2.中国中医科学院中药研究所(北京100700)

荷叶是睡莲科多年生水生植物莲(Nelumbo nucifera gaertn.)的新鲜或干燥成熟叶片，常在夏、秋两季采收[1]。莲作为兼具药食观赏价值的经济植物，在我国广泛种植。据统计,莲在我国的种植面积达500万亩以上，每年荷叶的采收量可达800万吨，资源非常丰富。在中华人民共和国卫生部的卫监发(1991)第45号文件中，荷叶被列入第二批“既是食品又是药品”的名单。传统医学认为,荷叶具有清暑化湿、生发清阳的功效，用于暑热烦渴，暑湿泄泻，脾虚泄泻，血热吐衄，便血崩漏等症[1]，记入药典的中药。近年来，关于荷叶的研究不断深入。荷叶的活性成分主要是荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、O-去甲基荷叶碱、N-去氢荷叶碱、O-去氢荷叶碱等生物碱以及芦丁、金丝桃苷等黄酮类化合物，现代药理研究表明其具有抑菌[2]、抗氧化[3]、调节血脂[4]等作用。刑毅[5]研究发现荷叶提取物能够降低小鼠血清 TC、TG、LDL-C 的水平，且高剂量下对其水平的改善与血脂胶囊相当，表明荷叶提取物具有降低血脂的功效。荷叶中的生物碱可通过活化AMPK信息通路，改善成熟脂肪细胞的糖脂代谢，从而产生调脂减肥的生理作用[6]。目前对荷叶的初步开发主要有茶剂、煎剂和胶囊等。随着时代的不断发展，健康逐渐成为关注的重点，具有减肥降脂功能的荷叶茶的研究逐渐成为热点，荷叶功能茶饮料[7]、荷叶降脂茶饮料、菊粉荷叶茶饮料等应运而生。由于荷叶潜在的临床和市场价值，成熟荷叶叶片在现代医学中被用于肥胖、高血脂症和高血压等的治疗，已成为开发天然、安全、特效减肥药品最具潜力的首选药材之一[8-9]。

本实验拟用一定的方法处理新鲜荷叶，获得荷叶茶产品，并通过高效液相色谱法分析荷叶中主要的活性成分——黄酮类和生物碱类成分，考察制茶工艺的稳定性。同时，采用正交试验设计，以荷叶碱与总黄酮成分为指标，确定荷叶茶的最佳浸提工艺，为荷叶茶作为绿色、健康的茶饮研究夯实基础。

材料和方法

1 主要仪器与试药 RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣)；色谱柱Sunfire C18柱、Xbridge Amide C18柱(沃特世，美国)；AEQ-120电子天平：岛津；1290-HPLC：安捷伦(安捷伦，美国)；标准品荷叶碱、金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷均来自安普公司；滤器0.22um安普公司电热恒温鼓风干燥箱(长沙医疗机械厂)；鲜荷叶：采用福建子莲产区新鲜荷叶。

2 研究方法

2.1 荷叶茶制作工艺：新鲜荷叶先切碎后用130℃微波杀青，碾磨后在150℃ 干燥5 min左右，逐步降温到130℃干燥5 min，100℃干燥5 min，即得荷叶茶。

2.2 黄酮和生物碱含量测定的色谱条件

2.2.1 黄酮化合物含量测定色谱条件：利用 Sunfire C18(150 nm×4.6 nm，3.5μm)色谱柱，在350 nm波长下，参照Chen et a[10]报道的色谱条件，流动相A为0.5%甲酸水，B为0.1%甲酸乙腈，梯度洗脱(0～10 min，12% B；10～32 min，12%～20% B；32～40 min，20%～30% B；40～48 min，30%～60% B；48～49 min，60%～12% B；49～53 min，12%)，流速0.6 ml/min，检测波长350 nm，柱温30℃，进样的体积为10 μl。

2.2.2 生物碱化合物含量测定色谱条件：利用Xbridge Amide C18(250 nm×4.6 nm，5 μm)色谱柱，在272 nm波长下，参照 Chen AD.[11]报道的色谱条件，流动相A为0.1%三乙胺，B为乙腈，梯度洗脱(0～15 min，40%～80% B；15～18 min，80% B；18～19 min，80%～40% B；19～22 min，40% B)，流速0.8 ml/min，柱温30℃，进样量10 μl。

2.3 标准品标准曲线的建立：精密称定金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷以及荷叶碱标准品，分别用纯化水稀释成六种适当的不同浓度，参照2.2 黄酮和生物碱含量测定的色谱条件分别进行含量测定。每个浓度测量3次，以标准品浓度值为纵坐标，平均峰面积为横坐标，建立标准曲线。

2.4 高效液相色谱法检测荷叶茶中黄酮和生物碱的含量：参照2.2 黄酮和生物碱含量测定的色谱条件对荷叶茶进行含量测定。

2.5 正交试验

2.5.1 正交试验设计：荷叶茶采用100℃沸水进行浸提，设置茶水比(A)、浸提次数(B)、浸提时间(C)3个因素，茶水比分别为30∶1，50∶1和80∶1，分别浸提1次，2次和3次，每次时间分别为10 min、30 min和60 min各三个水平。采用 L9(34)正交表设计优选最佳浸提工艺。因素水平表见表1。

表1 浸提因素和水平考察

2.5.2 正交试验与含量测定：精密称定荷叶茶1 g，按L9(34)正交试验表进行浸取实验。浸取完毕后，过滤，合并滤液，于旋转蒸发仪中减压浓缩至一定程度后，将浓缩液置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干。取纯化水2 ml溶解残渣，作为供试品溶液。平行3次，按标准品测定方法进行含量测定。

2.5.3 验证试验：精密称定荷叶茶1 g，按正交试验结果确定的工艺条件茶水比为50∶1，浸提2次，每次30 min，进行验证性试验。共检测3批次样品，测荷叶碱与总黄酮含量。

结 果

1 高效液相色谱法检测荷叶茶中黄酮和生物碱含量 用液相色谱法检测到荷叶茶中含有的黄酮和生物碱含量结果见图1和表2。图1为黄酮类化合物在液相上350 nm下的紫外吸收图和生物碱类化合物在液相上272 nm下的紫外吸收图，图中化合物的含量与表2是一致的。这一结果表明，鲜荷叶中活性黄酮类和生物碱类的成分都得到了很好的保留，荷叶茶制作工艺可行。

图1 荷叶茶中黄酮类化合物和生物碱类化合物的紫外吸收图

2 正交试验与含量测定结果 按正交试验设计，以3次平行实验的平均值为正交试验的结果值，表3。

3 试验结果的直观分析 对试验的结果进行直观分析，得到表4。由表4可知，总黄酮含量项下RA>RB>RC，即影响总黄酮含量的因素程度为A>B>C，说明茶水比是影响浸提总黄酮的最主要因素，浸提时间影响较小。生物碱含量项下RC>RB>RA，即影响生物碱含量的因素程度为C>B>A，表明浸提时间是影响浸提生物碱的最主要因素，茶水比影响较小。总黄酮含量与生物碱含量项下，各因素的K2值均大于K1和K3，反映各因素在水平2条件下，对浸提结果作用最大。故荷叶茶的最佳浸提工艺应为A2B2C2，既茶水比为50∶1，浸提2次，每次30 min。Ki=∑χi/3，Rχ=Kmax- Kminχ为因素i的水平。

表2 荷叶茶中黄酮类和生物碱类化合物的含量

表3 正交试验结果

4 验证试验结果 取3个批次荷叶茶，按最佳浸提工艺测得荷叶碱含量依次为467.44 μg/g、477.81 μg/g、472.64 μg/g，总黄酮含量依次为7088.12 μg/g、6967.45 μg/g、7007.39 μg/g。3个批次总黄酮含量均值为7020.99 μg/g，RSD值为0.88%；生物碱含量均值为472.63 μg/g，RSD值为1.10%，总黄酮与生物碱的含量与正交初步筛选出来的浸提工艺A2B2C2的试验结果仅有微小差别，表明优选出的浸提工艺稳定且提取效果佳，适合荷叶茶的浸提。

表4 正交试验直观分析

讨 论

荷叶具有降血脂作用，将荷叶与黑茶组方后，不仅可以明显改善内生湿热证患者的湿热内蕴症候表现、高血压状态、降低甘油三酯、提高HDL-C、改善胰岛素抵抗的功效，同时还可以降低炎症因子TNF-a、IL-1和肿瘤相关指标，并可能对预防饮食相关的肿瘤有一定的作用[12]近年发现荷叶还具有抑制脂肪肝，抗动脉硬化、保护心血管，抗病毒、保肝、抗纤维化等药理活性[8]。有的药理作用还没有被充分利用，大多用于复方制剂中，其原因是：操作程序没有规范化、标准化，使质量不能得到有效的控制[13]。微波杀青工艺制作的荷叶茶，能够很好地保留荷叶中的各种活性黄酮和生物碱类成分。

荷叶是一种常见的药食同源中药，在我国分布广泛,资源丰富，价格低廉，但大部分都自然凋零废弃在田地中，没有有效的利用起来，造成了资源的极大浪费。不仅如此，废弃的荷叶可能会污染河道，降低水质，致使荷塘沼泽化，不利于生态的健康可持续发展。将荷叶制作成保健茶的方式，使用和贮藏方便、简单，用药依从性好，能促进中药资源更好地开发利用。100°C沸水常用于泡茶，所以,本试验利用其作为荷叶茶的浸提溶剂，更具实用性。

生物碱和黄酮类化合物是荷叶的主要活性成分，荷叶碱为荷叶中最主要的生物碱[14-15]，其亦是中药荷叶质量的重要考察指标[16-17]。金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷是荷叶黄酮类化合物的主要成分[1]，故以其总含量作为总黄酮含量考察具有代表性。下一步实验将涉及对荷叶有效成分的毒副反应及药效评价的研究。

目前荷叶茶品种单一，档次低下，荷叶资源有待充分挖掘和利用。通过优化荷叶的提取工艺，革新荷叶茶的制作工艺，丰富荷叶茶的品种，增强荷叶茶的感官品质和稳定性，为荷叶茶制作标准的制定和有效利用荷叶资源提供实验基础，对荷叶茶的深加工与后续研究甚至周边产业的发展，具有重要的价值。