降糖因子铬调素的制备

闵玉涛，宋彦显，马庆一，刘 鑫

(1.郑州工程技术学院 化工食品学院，河南 郑州 450044 ；2.郑州轻工业大学 食品与生物工程学院,河南 郑州 450002；3.湖北中烟工业有限责任公司 研发部,湖北 武汉 430000)

糖尿病是由于代谢混乱造成的一种慢性疾病，目前尚不可治愈，糖尿病药物市场是当前价值最大和数量增长最快的医药市场之一。2017年国际糖尿病联盟发布的报告显示，全球糖尿病患者达4.25亿。中国是糖尿病患者最多的国家，达到1.14亿，预计2035年糖尿病患者将达到5.92亿[1]。糖尿病患者日益增加，受医疗条件限制，未检出该病患的人数众多，且有年轻化趋势，已严重影响到人类健康。目前，上市的糖尿病治疗药物以化学合成药物为主，不可避免地给患者带来一定的毒副作用[2-3]，对患者造成一定的痛苦。因此，糖尿病药物的开发任重而道远。

铬是人体必需的微量营养元素之一，是体内葡萄糖耐量因子(glucose tolerance factor，GTF)的重要组成成分[4]。1957年美国的医学科学家MERTZ和SCHWARZ提出了啤酒酵母中含有葡萄糖耐量因子GTF的假设，并于1959年证实其重要组成成分是Cr3+。MERTZ后来证实了铬是葡萄糖代谢时胰岛素发挥作用所必需的一种元素[5]。铬与胰岛素两者缺一或单独存在都会影响到对葡萄糖的利用。1980年科学家终于在动物的肝、肾中获取了类GTF物质LMWCr(Low-Molecular-Weight Chromium)，被科学界重新译为“铬调素”。LMWCr与胰岛素介导反应有关，它可与胰岛素受体结合，激活受体酪氨酸激酶活性，在胰岛素信号自动放大机制中扮演着重要角色。LMWCr是目前公认的铬的生物活性形式[6]。

DAVIS等[7]证实LMWCr在激活胰岛素受体激酶活性过程中起关键作用。JAIN等[8]表明LMWCr可以增强胰岛素的结合力，增加胰岛素受体的数目。它通过激活胰岛素受体激酶和抑制胰岛素受体酪氨酸磷酸酶来增加胰岛素受体的磷酸化作用，从而提高胰岛素的敏感性。吴扬等[9]制备了鞣酸与铬的化合物并用于治疗糖尿病效果明显。DAVIS等[10]合成了铬的聚合物[Cr3O(O2CCH2CH3)6(H2O)]+，实验表明此化合物可以激活胰岛素受体上的蛋白酪氨酸磷酸激酶，可用于Ⅱ型糖尿病的治疗。由此可见，铬调素对于预防糖尿病及其并发症有着极其重要的作用。上述的报道表明了从天然产物及其铬调素类似物中筛选新的降糖因子是一个颇具潜力的研究领域，但是目前此领域已完成的研究工作，无论从深度(对机制的探讨)还是广度(筛选对象)上尚嫌不足，有广阔的研究空间。

本文按照Toepfer法制得LMWCr浓缩液，以蛋白酪氨酸磷酸酶为靶酶，测定其抑制作用，可作为蛋白酪氨酸磷酸激酶抑制剂筛选的基准物，为铬调素类似物的筛选提供依据，为糖尿病药物的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

PDA斜面培养基：按照GB4789.15进行配制，用于菌种的复苏及保存；种子培养基[11]：葡萄糖2%，甘氨酸1%，酵母粉0.1%，调节至pH 6.0，主要用于发酵菌种的培养；发酵培养基：由麦芽汁(12～13Bx)添加经预杀菌的三氯化铬(20mg/mL)组成，培养基配好后在121℃下高温灭菌30min；啤酒酵母：安琪酵母股份有限公司；蛋白酪氨酸磷酸酶，实验室自制；工业专用粉状活性炭：江苏瑞晨碳业科技有限公司；GF254薄层层析硅胶板：青岛邦凯高新技术材料有限公司；茚三酮：AR级，北京吉美生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

756MC紫外分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；HYG-Ⅲ旋转式恒温调速摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备有限公司；SXK-103超净工作台：中国蚌埠净化仪器厂；LRH-150S恒温恒湿培养箱：广东省医疗器械厂；YXQ.SG41.280 B电热手提式压力蒸汽灭菌锅：上海医用核子仪器厂；JA1003电子天平：上海精科天平厂。

1.3 实验方法

1.3.1 菌种的活化

将啤酒酵母接种到PDA斜面培养基上，置于恒温培养箱中在28℃下培养，以恢复其活力。

1.3.2 种子培养

将啤酒酵母菌种接种于50 mL种子培养基中，180r/min，28℃下培养18h，进行种子培养。

1.3.3 发酵培养[12]

种子培养基按10%接种量接种于50 mL含铬发酵培养基中，28℃静置培养6h后，180r/min，28℃下摇瓶培养18h，得到新鲜的高铬酵母。酵母菌培养液3000r/min离心10min，沉淀用去离子水反复冲洗，直至检测不出铬离子为止。富铬酵母于60℃干燥，粉碎，得淡黄色的富铬酵母粉。

1.3.4 从酵母中分离LMWCr[13]

按照TOEPFER法[14]，将富铬酵母悬浮于50%的乙醇溶液中，搅拌，加热至沸后，冷却至室温过夜，过滤后去残渣，减压蒸出乙醇，水溶液调至pH3.5，用活性炭吸附LMWCr，过滤后弃掉滤液，依次用95%乙醇及水洗涤活性炭，滤液悬浮于11的浓氨水-乙醚液中，经洗脱、浓缩后，即得到LMWCr浓缩液。

1.3.5 LMWCr对蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP 1B)的抑制动力学

底物浓度27.22 mmol/L时，取一定量的LMWCr浓缩液，在37 ℃，pH7.20，Tris-HC1缓冲溶液(10 mmol/L)所产生的离子强度下进行酶促反应，405 nm处定时测定其吸光度。以吸光度每分钟增加0.001为1个相对活力单位。试验设计见表1。

表1 LMWCr对蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP 1B)抑制活性的反应体系

以第9min的吸光度计算各成分的抑制率，

式中：ρ—铬酵母对蛋白酪氨酸酶的抑制率；

A0—无抑制剂时的吸光度；

A1—组分的吸光度。

2 结果与分析

2.1 LMWCr水解液的薄层层析

取LMWCr浓缩液1mL，加入0.2%茚三酮试液2～3滴，加热煮沸4～5min，待其冷却后呈蓝紫色，表明有肽或氨基酸存在。

LMWCr浓缩液用6mol/L盐酸回流煮沸20h左右，使肽完全水解，水解液硅胶板薄层层析，结果如图1。

从图1中可以看出，LMWCr浓缩液经水解后，含有4种不同的氨基酸，这与刘亚明[15]、李平[16]等提到的GTF中含有4种氨基酸的结论相吻合。

图1 LMWCr水解液薄层层析图

2.2 富铬酵母的紫外吸收光谱扫描分析

对所得到的LMWCr浓缩液进行紫外扫描，结果见图2。

图2 LMWCr浓缩液紫外扫描图

从图2可见，浓缩液在 260nm 处有一明显吸收峰，这与金婵等[17]研究富铬酵母时发现其在260nm有一紫外吸收峰、丁文军[18]和HAYLOCK等[19]报道 GTF 在 260nm 处有相同紫外吸收特征峰一致。同时，测定三氯化铬溶液时无此特征吸收峰，再结合薄层层析结果，表明富铬酵母铬复合物已成功制得。

2.3 LMWCr对PTP 1B的抑制活性

在底物浓度为27.22 mmol/L，LMWCr浓缩液为20.13μL时，以不加LMWCr为标准对照，在405 nm处测定其随时间变化的吸光度，绘制透析酶的时间-吸光度曲线图，如图3所示。

图3 LMWCr对PTP 1B的抑制活性时间-吸光度曲线

在405 nm处测定第9min的吸光度，计算抑制率为13.60%。PTP1B抑制剂通过削弱PTP1B对胰岛素受体的去磷酸化作用，以提高胰岛素受体及其底物的磷酸化水平，进而起到类胰岛素和胰岛素增敏的作用，达到降糖的效果[20]。LMWCr对PTP 1B有显著的抑制作用，进一步证实了其可以作为降糖因子，可以把PTP 1B的抑制剂制备铬络合物，进一步提高其降糖效果。

3 结论

LMWCr是目前公认的铬的生物活性形式，再加上酵母铬研究条件比较成熟，因此，本文选择酵母铬为筛选蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂的基准物。按照TOEPFER法制得LMWCr浓缩液，通过薄层层析和紫外扫描得以验证，表明已成功从富铬酵母中制得了铬复合物。LMWCr对PTP 1B的抑制率达13.60%，PTP 1B的抑制剂可制备铬络合物，提高降糖活性，为铬调素类似物产品的研发等提供参考。