壮药依肝达对免疫抑制小鼠免疫功能的影响*

李以军，张文涛，郑作文△

(1.广西医科大学附属民族医院药剂科，南宁 530001；2.广西中医药大学药理教研室，南宁 530200)

壮药依肝达是由饭汤子、田基黄、三姐妹3味药组成，其中饭汤子具有清热利湿、活血止血的功效；田基黄有散瘀止痛、清热利湿、消肿解毒的功效；三姐妹具有发散风寒、解毒、消肿止痛的功效。三味药在广西地区广泛用于治疗急慢性肝炎[1-3]。依肝达以饭汤子为公药，田基黄与三姐妹为母药组成复方中药，用于乙型肝炎治疗，课题组前期研究已证实其不仅能抗乙型肝炎病毒[4-6]，而且有保肝降酶的作用[7]，故本实验以免疫抑制小鼠为模型，观察依肝达对免疫抑制小鼠免疫功能的影响，以阐明依肝达是通过直接抑制病毒、保肝护肝及增强免疫功能三个方面协同起到治疗乙型肝炎的，为进一步研究其作用机制提供药理学基础，现报道如下。

1 材料与方法

1.1动物、试剂及仪器 无特定病原体(SPF)级昆明小鼠，体质量18～22 g，雌雄兼用，购自广西医科大学实验动物中心(生产许可证号：SCXK桂2009-0002)，适应喂养3 d后进行实验。环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号H32020857)；刀豆蛋白(ConA，美国Sigma公司，批号C8110)；印度墨水(北京市西中化工厂，批号060524)；盐酸左旋咪唑片(桂林南药股份有限公司，批号120202)；RPMI-1640培养基(美国Gibco公司,批号1243097)；2,4-二硝基氯苯(DNCB,成都西亚化工股份有限公司，批号201002161)；紫外分光光度计(美国PeiRinElmer公司)；电子天平(德国Sartorius公司，型号BP211D)；酶标仪(奥地利Sunrise公司)；高速低温离心机(德国Biofuge Stoctos 公司)。

1.2方法

1.2.1药物的制备 依肝达浸膏：由广西中医药大学药学院药剂教研室制备。制备方法：取三姐妹200 g、饭汤子300 g、田基黄150 g，混匀后用10倍体积量95%乙醇浸泡2 h后水浴回流提取1.5 h，趁热过滤，药渣继续用8倍体积量95%乙醇水浴回流提取1.0 h，趁热过滤，再合并两次滤液浓缩得40.4 g黑棕色浸膏，1.0 g浸膏相当于13.6 g生药量。依肝达高剂量：取10.0 g浸膏(相当于136.0 g生药量)用纯净水溶解稀释定容至160 mL，得0.85 g生药/mL；依肝达中剂量：取高剂量依肝达加纯净水稀释1倍；依肝达低剂量：取中剂量依肝达加纯净水稀释1倍。

1.2.2依肝达对免疫抑制小鼠血清溶血素(IgM)水平的影响 将SPF级昆明小鼠按体质量分为空白组(生理盐水)，模型组(生理盐水)，阳性组(左旋咪唑0.5 g/kg)，依肝达高、中、低剂量组(依肝达剂量分别为17.00、8.50、4.25 g生药/kg)，每组12只小鼠。各组灌胃给药，1次/d，连续10 d，给药体积均为20 mL/kg。除空白组外，其余各组小鼠从给药第1天起，每2天背部皮下注射环磷酰胺溶液，剂量0.4 g/kg。在第5天，每只小鼠腹腔注射5%(v/v)的鸡红细胞悬液0.2 mL。小鼠末次给药1 h后，拔眼球取血，离心制备血清，参照血清IgM的检测方法[8]，先用生理盐水将血清稀释500倍后取0.5 mL加入试管中(空白对照用生理盐水代替血清)，再依次加入0.5 mL的5%鸡红细胞悬液、10%补体(采集3只豚鼠血，混合分离血清，用生理盐水稀释成10%浓度)、生理盐水，充分混匀后，37 ℃孵育1 h，3 000 r/min离心5 min，取上清液测量其540 nm处光密度值(OD)值，按下面公式计算IgM水平以HCIgM表示。HCIgM=标本血清的OD值×稀释倍数。

1.2.3依肝达对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 末次给药1 h后，参照巨噬细胞吞噬功能测定方法[9]，各组小鼠尾静脉注射10%印度墨水(0.1 mL/10 g)。分别于注射后2 min(t1)、10 min(t2)用毛细管从眼眶取血0.02 mL，加入含2 mL 0.1% Na2CO3溶液的试管中混匀，在波长600 nm下测OD值(得OD1、OD2值)。然后取出肝和脾称质量，按下面公式计算吞噬指数K值和吞噬系数α值。 K=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)，α=1/3×K×体质量/(肝质量+脾质量)。

1.2.4依肝达对免疫抑制小鼠补体C3、C4水平的影响 末次给药1 h后小鼠眼球取血，低温分离血清，当日送往广西中医药大学第一附属医院检测补体C3、C4水平。

1.2.5依肝达对免疫抑制小鼠迟发型超敏反应的影响 各小鼠第1天给药后均腹部脱毛，并在脱毛部位均匀涂上1% DNCB 丙酮溶液致敏。末次给药1 h后，在各小鼠右耳均匀涂抹1% DNCB 丙酮溶液，24 h后处死小鼠，剪下左、右耳壳，用8 mm打孔器在双耳同一部位打下耳片并称质量，计算左、右耳片质量差值。

1.2.6依肝达对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响 于末次给药后第2天处死小鼠，参照脾淋巴细胞增殖实验方法[10]，无菌环境中取脾，用无菌D-Hanks 液冲洗后，200目不锈钢细胞筛过滤，细胞液1 000 r/min离心，弃上清液，加入红细胞裂解液，吹打混匀后离心，弃上清液，用D-Hanks 液洗涤2次后转移至含10%小牛血清RPMI-1640培养液中，于CO2培养箱中培养2 h，培养液中悬浮着脾淋巴细胞，小鼠脾巨噬细胞贴壁生长，分离脾淋巴细胞后，将细胞浓度调成1×107/mL，加入96 孔板，每孔100 μL，再加入含有ConA的培养液100 μL，使ConA终浓度为10 μg/mL。置培养箱培养44 h，四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测，用酶标仪在波长570 nm 处测OD值。

2 结 果

2.1依肝达对免疫抑制小鼠血清IgM水平的影响 模型组小鼠的血清IgM水平低于空白组，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，阳性组，依肝达高、中、低剂量组IgM水平均有显著提高，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 依肝达对小鼠IgM水平的影响

a：P<0.01，与空白组比较；b：P<0.01，与模型组比较；-：无数据

2.2依肝达对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 模型组小鼠吞噬指数K与吞噬系数α较空白组降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，说明免疫抑制小鼠模型制备成功。与模型组比较阳性组小鼠的吞噬指数K与吞噬系数α升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较，高剂量依肝达组小鼠吞噬指数K与吞噬系数α也升高，与模型组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 依肝达对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响

a：P<0.05，b：P<0.01，与空白组比较；c：P<0.05，与模型组比较；-：无数据

2.3依肝达对免疫抑制小鼠血清补体C3、C4水平的影响 模型组小鼠血清补体C3、C4水平与空白组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，说明免疫抑制小鼠模型制备成功。与模型组比较，阳性组小鼠血清补体C3、C4水平均增高，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)；依肝达高、中、低剂量组C3水平均升高，差异有统计学意义(P<0.01)，但对C4水平并无影响，见表3。

表3 依肝达对补体C3、C4水平的影响

a：P<0.05，与空白组比较；b：P<0.05，c：P<0.01，与模型组比较；-：无数据

2.4依肝达对免疫抑制小鼠迟发型超敏反应的影响 模型组小鼠左、右耳质量差值与空白组比较明显下降，差异有统计学意义(P<0.01)，提示迟发超敏反应降低，免疫抑制小鼠模型制备成功。与模型组比较，阳性组小鼠左、右耳质量差值显著增高，依肝达高剂量组左、右耳质量差值显著增高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表4。

2.5依肝达对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞增殖作用的影响 模型组小鼠脾淋巴细胞增殖能力较空白组显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)，说明免疫抑制小鼠模型制备成功。阳性组与依肝达高、中、低剂量组小鼠脾淋巴细胞增殖能力较模型组均显著提高，差异有统计学意义(P<0.01)。见表5。

表4 依肝达对小鼠迟发超敏反应的影响

a：P<0.01，与空白组比较；b：P<0.05，与模型组比较；-：无数据

表5 依肝达对脾淋巴细胞增殖的影响

a：P<0.01，与空白组比较；b：P<0.01，与模型组比较；-：无数据

3 讨 论

机体免疫功能低下是乙型肝炎患者的表现之一[11]，主要原因是体内免疫功能长期处于耐受状态，不能清除病毒而导致，针对乙型肝炎的治疗，需从抑制病毒、保肝护肝和增强机体免疫功能3个环节同时入手。壮药依肝达作为复方中药，能起到“多环节、多靶点、综合调节”的临床作用，前期研究已发现其能抑制乙型肝炎病毒复制及保肝降酶，故本研究着重探讨其对机体免疫功能的作用。

机体免疫系统由免疫器官、免疫细胞及免疫活性因子构成。免疫器官包括骨髓、胸腺、肝脏、淋巴结、脾和黏膜等，免疫细胞包括巨噬细胞和淋巴细胞，免疫活性因子包括抗体、溶菌酶、补体、免疫球蛋白、细胞因子等，当机体受到外来毒素侵袭时，3个部分的免疫物质会通过协同作用发挥机体防疫功能。

单核-巨噬细胞系统在机体免疫系统中占有很重要的作用，担负着机体非特异性的防御功能，其组成有单核细胞和巨噬细胞，其主要功能是吞噬和杀灭病原菌、对细菌毒素进行灭活、抗原递呈作用及释放干扰素和白细胞介素等细胞因子，参与细胞免疫[12]，因此，巨噬细胞的吞噬指数K和吞噬系数α是反映机体非特异性免疫功能的重要指标。实验结果发现，高剂量依肝达(17 g/kg)能提高吞噬指数K及吞噬系数α，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示依肝达能提高巨噬细胞的吞噬功能。

免疫球蛋白包括IgG、IgA、IgD、IgE、IgM，主要存在于血液及组织液当中。当机体被病原微生物等抗原刺激后，免疫球蛋白会与抗原生成抗原-抗体复合物，能有效阻断病原体的致病作用[13]。其中IgM是机体体液免疫应答中最早合成和分泌的抗体，在机体特异性免疫中起到重要作用，它的变化能及时体现B细胞活性状况，是反映机体免疫功能的重要指标之一[14]。实验结果发现，依肝达高、中、低剂量组均能提高免疫抑制小鼠IgM水平，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，结果提示依肝达能增加免疫球蛋白IgM水平。

补体系统是体内非特异性免疫系统的重要组成部分，C3是补体经典激活途径、替代激活途径和凝集素激活途径都必要的枢纽成分，在血清中诸补体成分中水平最高[15]。C4在血清中诸补体成分中水平仅次于C3，是参与补体传统途径活化的成分，合成于肝细胞和巨噬细胞。C4在激活补体，促进吞噬，防止免疫复合物沉淀和中和病毒等方面发挥作用。实验结果发现依肝达高、中、低剂量组均能提高免疫抑制小鼠补体C3水平，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)，但对C4水平无影响。

迟发型超敏反应是抗原诱导引起的细胞性免疫应答，当效应T细胞与特异性抗原结合反应，引起的以单核细胞浸润和组织损伤为主要特征的炎性反应。此超敏反应发生与抗体和补体无关，而与效应T细胞和吞噬细胞及其产生的细胞因子或细胞毒性介质有关。实验结果发现，依肝达高剂量组能提高免疫抑制小鼠左、右耳质量差值，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示依肝达能增强免疫抑制小鼠迟发型超敏反应。

脾淋巴细胞是体内免疫活性细胞，其增殖和分化能力是评价机体细胞免疫功能的重要指标之一。脾脏中T淋巴细胞是重要的免疫活性细胞，它能被有丝分裂原ConA所激活并向淋巴母细胞转化，在转化过程中 DNA、RNA及蛋白质合成增加，使细胞分裂增殖，测定体外脾淋巴细胞转化功能是研究细胞免疫功能的重要手段[16]。实验结果发现，依肝达高、中、低的剂量组均能促进免疫抑制小鼠脾淋巴细胞的增殖，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。

综上所述，壮药依肝达能提高免疫抑制小鼠的免疫功能，其作用主要包括提高IgM水平，增强巨噬细胞的吞噬功能，提高补体C3水平，增强迟发型超敏反应及脾淋巴细胞增殖活性。