不同灭菌与冷却方式对酱油品质的影响研究

周朝晖

(广东珠江桥生物科技股份有限公司，广东 中山 528415)

我国是世界上酱油产销量最大的国家，提升酱油品质是每个酱油生产厂家一直以来研究的热点，提升酱油品质主要有两大途径：一是改进制造过程生产工艺；二是提升后期调配质量。目前对酱油杀菌工艺的改进研究较多，尹倩等[1]对高压脉冲电场杀菌技术在酱油生产中的应用进行了初步探讨；Gao等[2]研究表明，杀菌工艺是酱油香味物质形成的关键步骤，对成品酱油色泽、香味、滋味的定型具有重要作用；孙连贵[3]研究表明，杀菌过程在杀灭生酱油中酵母菌、乳酸菌，使生酱油中内源酶失活的同时，还可以调和酱油风味。

目前对生酱油灭菌后的冷却方式研究较少，灭菌结束后，降温工艺也会影响酱油的风味品质，因为高温会使酱油继续发生美拉德反应，从而对酱油的色泽和风味产生影响。一般酱油生产厂家在生酱油灭菌后采用自然降温的方法，自然降温所需时间长，长时间美拉德反应会对产品品质产生负面影响，并且季节变换对其降温时间也有影响。本文研究的主要内容是不同灭菌温度以及不同冷却方式对酱油品质的影响，为酱油生产工艺的改进提供了一定的理论基础和方法指导。

1 材料与方法

1.1 实验材料

同一批次生酱油(未杀菌)，放置于4 ℃冰箱中保藏备用，此生酱油由广东珠江桥生物科技股份有限公司提供；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

EL204/EL3002电子天平 瑞士梅特勒-托利多集团；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱 上海齐欣科学仪器有限公司；DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱 上海申贤恒温设备厂；封闭电炉 常州市金坛友联仪器研究所；紫外分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限责任公司；Waters600高效液相色谱仪 美国Waters公司；916 Ti-Touch万通滴定仪 瑞士万通中国有限公司；电磁炉 浙江绍兴苏泊尔电器有限公司。

1.3 生酱油灭菌条件和冷却条件设计

1.3.1 实验流程

生酱油→加热→达到灭菌温度(90 ℃或98 ℃)保温20 min→灭菌后立即分装→放置到所设定保温箱中进行保温→保温结束后于4 ℃冷藏待用。

1.3.2 灭菌及冷却条件设计

由于生酱油在经过90 ℃灭菌维持20～30 min后，灭菌率可达98%[4]，所以加热灭菌应选择的温度为≥90 ℃，维持时间20 min，具体设计参数及酱油编号见表1，以下内容所涉及的编号都同表1相对应。

表1 灭菌及冷却参数设计表 Table 1 Design table of sterilization and cooling parameters

1.4 检测方法

1.4.1 还原糖的测定

样品的前处理及测定参考GB/T 5009.7-2016[5]，采用直接滴定法对酱油中还原糖进行测定，设蓝色刚好褪去为终点，同法平行操作3次。

1.4.2 氨基酸态氮的测定

采用甲醛电位滴定法测定酱油中游离氨基酸态氮含量，以蒸馏水为空白对照，取1 g酱油，加入蒸馏水至80 g，以0.1 mol/L的NaOH滴定至pH 8.2，加入10 mL甲醛，继续滴定至pH 9.2，得空白对照样和样品加入甲醛后消耗的NaOH体积V0及V1。酱油的氨基酸态氮含量为：氨基酸态氮=[(V1-V0)×0.1×0.014/2]×100%。

1.4.3 酱油中肽分子量分布的测定

采用高效液相色谱法进行酱油肽分子量分布的测定。参考GB/T 22492-2008[6]。

色谱条件：色谱柱采用TSK gel G2000 SWXL，流动相为0.1%三氟乙酸水溶液与乙腈按照8∶2混合，检测波长为220 nm，流速为1 mL/min，检测时间为20 min，进样体积为20 μL。

标准肽样品：牛血清白蛋白(68000 u)、马心细胞色素C(12384 u)、抑肽酶(6511 u)、Gly-Gly-Gly(189 u)，相对分子质量对数值与洗脱体积拟合直线方程为y=-0.5768x+8.1687(R2=0.9971)，其中y为标准肽分子量对数，x为洗脱体积。

1.4.4 酱油中色率的测定

酱油色率的检测参考孙宇霞[7]的方法，将酱油稀释到一定倍数，用分光光度计，在520 nm的波长下，以蒸馏水做空白，测定吸光度A值，再将A值乘以一常数K(斜率，由标准曲线确定)，得到酱油色率。将灭菌后不同编号的酱油放置在37 ℃条件下保温0 d和15 d，测定色率，对比稳定性。

1.4.5 酱油的感官评定

本实验由6位经过训练的感官人员(3男3女，年龄在25～35岁)对酱油进行评价，对酱油的香气及口感进行描述及评分，评分为1～10分，见表2，口感程度越高分数越高，香气评分为喜好综合评分。并参考GB/T 18186-2000中的5.2对香气及口感进行描述[8]。

表2 酱油的感官评分尺度表 Table 2 Sensory scoring scale of soy sauce

1.5 统计分析

每个实验重复3次平行，采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，采用ANOVA进行差异显著性分析，显著性水平为0.05，采用Excel软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 还原糖结果与分析

测定不同杀菌和冷却工艺下酱油的还原糖含量可以在一定程度上反映出灭菌及冷却过程中美拉德反应程度。

图1 不同酱油的还原糖含量Fig.1 Reducing sugar content of different kinds of soy sauce

由图1可知，不同杀菌和冷却工艺条件下酱油的还原糖含量无显著性差异(p>0.05)，还原糖含量均在4.28～4.82 g/100 g之间；灭菌后的酱油与生酱油(0#)对比，还原糖含量均有少量下降，这与加热灭菌及冷却过程中还原糖参与美拉德反应有关；但在相同灭菌条件下，不同冷却方式会明显影响酱油中的还原糖含量，其中1#降温方式(模拟自然降温方式)相比其他降温方式的酱油还原糖含量较低，如在90 ℃条件下灭菌20 min，即1-1#、1-2#和1-3#的还原糖含量分别为4.55，4.80，4.71 g/100 g；采用不同温度(90 ℃和98 ℃)灭菌、相同降温方式所得的酱油的还原糖对比，98 ℃灭菌酱油还原糖含量均略低于90 ℃灭菌酱油，如1-1#和2-1#的还原糖含量分别为4.55，4.28 g/100 g，这与高温下美拉德反应程度较深，消耗还原糖更多有关。

结合感官中的香气评分，1-3#和2-3#的香气评分值较高，主要是因为在高温下保温时间更长，会加剧美拉德反应程度，改变酱油的微观成分结构，从而影响其香气评分。

2.2 氨基酸态氮结果与分析

氨基酸态氮含量与酱油等级相对应，在加热灭菌和冷却过程中，如果酱油长时间处于高温环境中，会对酱油品质产生负面影响，除对风味影响较大外，对营养氨基酸的损失也会较明显。

图2 不同酱油的氨基酸态氮含量 Fig.2 Amino acid nitrogen content of different kinds of soy sauce

测定不同杀菌和冷却工艺下酱油的氨基酸态氮含量，由图2可知，不同酱油的氨基酸态氮含量之间无显著性差异(p>0.05)，其氨基酸态氮含量均在0.84%～0.88%之间，与邓岳等[9]的研究结果一致；灭菌后的酱油与生酱油进行对比，其氨基酸态氮含量都有少量下降，主要是灭菌及冷却过程中少量氨基酸及小分子肽参与美拉德反应所致；不同灭菌温度(90 ℃和95 ℃)、相同降温方式，对应的氨基酸态氮含量无明显差别；相同灭菌温度、不同降温方式，3#降温方式(快速降温方式)所得酱油的氨基酸态氮含量值较高，如98 ℃灭菌20 min，2-1#、2-2#和2-3#的氨基酸态氮含量分别为0.84%、0.85%、0.86%。从氨基酸态氮结果来看，不同灭菌和冷却工艺下的酱油与生酱油相比氨基酸都会有少量的损失，这是无可避免的，但差异不明显。

2.3 肽分子量分布结果与分析

表3 不同酱油的肽分子量分布情况 Table 3 Molecular weight distribution of peptides in different kinds of soy sauce

由表3可知，不同灭菌及冷却方式所得酱油的肽分子量分布无显著性差异(p>0.05)。根据分子量大小，将酱油肽分子量分为5个组分，包括<500 u、500～1000 u、1000～3000 u、3000～5000 u和5000～10000 u。不同酱油中分子量<500 u的短肽占主要部分，所占百分比均在89.50%～94.25%之间；不同灭菌温度、相同冷却方式的酱油相比，各分子量区间下的百分比例相差不明显，即1-1#和2-1#对比，1-2#和2-2#对比，1-3#和2-3#对比；0#、1-3#和2-3#酱油中<500 u的短肽百分比分别为93.73%、94.25%和94.05%，1-1#和2-1#酱油中<500 u的短肽百分比分别为90.04%和89.50%，即采用灭菌后快速冷却方式(快速降温到45 ℃保持24 h)其<500 u的短肽含量比模仿自然降温方式(85 ℃保持8 h，65 ℃保持8 h，45 ℃保持8 h)的短肽含量高，与生酱油中<500 u的短肽无明显差异。

庄明珠[10]的论文中有相关低分子肽的描述，包括有学者将日本酱油经过超滤分成不同组分，发现小分子组分的鲜味和咸味比其他组分更加强烈；也有学者探讨了印度尼西亚酱油，发现低于500 u组分的呈味效果最好，并推测酱油中小分子肽是印度尼西亚酱油呈鲜味的物质基础。本研究结合感官评定结果，发现1-3#和2-3#冷却方式在鲜味呈味上较其他冷却方式分数较高，这也与低分子肽含量值较高相对应。

2.4 色率结果与分析

目前，我国对酱油的色度无统一标准和测定方法，但可以确定的是酱油的色率值越高，颜色越深。因此，对分别测定不同灭菌和冷却工艺酱油的色率值，可在一定程度上了解其色泽变化情况；在储存期间，酱油的色率值均会逐渐升高，表明其颜色在逐渐加深，对不同灭菌酱油进行初始及保温过程中(37 ℃下保温)的色率值检测，从而观察灭菌工艺对色率的影响以及储藏过程中色率的变化。通过对比相同灭菌工艺，不同降温方式酱油的色率，发现1#降温方式的色率值最高，即模仿自然冷却的工艺，与其他两种降温方式相比有显著性差异(p<0.05)，说明灭菌后酱油长时间保持高温，会使美拉德反应较为剧烈，从而提高色率值；相同降温方式，98 ℃灭菌条件下的酱油色率值相比90 ℃灭菌条件下的酱油色率值偏高，但无显著性差异(p>0.05)；37 ℃保温15 d，其酱油的色率值与初始0 d的数值进行对比，均有一定程度的上升，即0 d和15 d色率值对比有显著性差异(p<0.05)；结合表4，保温15 d，不同灭菌温度下的酱油色率值对比，98 ℃灭菌条件下的酱油色率相对增加缓慢，可能是因为经过更高温度(98 ℃>90 ℃)的杀菌，起始美拉德反应程度较深，反应所需要原料(如氨基酸和还原糖等)损耗较多，从而减缓了后期储藏过程中褐变反应速率。不同灭菌酱油在0 d和15 d的色率值见图3。

表4 不同灭菌酱油在37 ℃储藏后的色率增加率 Table 4 The increase rate of color rate of different sterilized soy sauce stored at 37 ℃

图3 不同灭菌酱油在0 d和15 d的色率值Fig.3 Color rate of different sterilized soy sauce at 0 d and 15 d

注：同系列不同字母者表示差异显著(p<0.05)，同编号不同字母者表示差异显著(p<0.05)。

生酱油的色率值为1.18，灭菌后酱油的色率值与生酱油相比均有一定的提升，在1.68～3.26之间，灭菌及冷却过程会加深酱油的色泽，这与之前所描述的美拉德反应情况对应；在储藏过程中色泽都有一定程度的加深，可能是在储存过程中由于空气和储存温度的影响，酱油发生了褐变反应；较高灭菌温度下的酱油在储存过程中色率增加值相对较缓慢，可能较高温度的加热，其初始色率较高，但同时增加了其色泽的稳定性，后期色泽变化也较小。谢媛利等[11]研究表明，酱油加热时间越长，其色泽浓化越显著，从而增加色泽的稳定性，使得储藏过程中色泽的变化较小。

2.5 感官结果与分析

酱油风味是“色、香、味、体”的综合体现，即酱油的色泽、香气、滋味、体态。色泽是直观指标，已在上文对其进行了详细描述，本章节主要对香气和滋味进行评分。不同酱油的感官评分表见表5。

表5 不同酱油的感官评分Table 5 Sensory scoring table of different kinds of soy sauce

评判酱油的优劣，香气很重要，整体上灭菌后酱油的香气都有一定程度的提升，明显减少生豆气味，突出豉香，香味更纯正，这也与加热过程中发生美拉德反应，提升香气有很大关系；口感上灭菌后酱油的浓厚感和鲜味都有一定的提升，另外入口咸味也有一定程度的提升；相同灭菌条件、不同降温方式的酱油对比，结合评分表(见表5)及风味雷达图(见图4和图5)。

图4 90 ℃灭菌条件下不同冷却方法酱油风味雷达图 Fig.4 Radar map of soy sauce flavor under different cooling methods at 90 ℃ sterilization condition

图5 98 ℃灭菌条件下不同冷却方法酱油风味雷达图Fig.5 Radar map of soy sauce flavor under different cooling methods at 98 ℃ sterilization condition

3#(快速降温方式)的香气豉香更加浓郁，得分较高，鲜味得分也较高；不同灭菌条件(90 ℃和98 ℃)下3#降温方式的酱油对比，结合评分表(见表5)及风味雷达图(见图6)，98 ℃灭菌条件下的酱油浓厚感、协调性及香气分数都稍优于90 ℃灭菌条件下的酱油；但鲜味分数稍差于90 ℃灭菌条件下的酱油。

图6 快速冷却条件下不同灭菌温度酱油风味雷达图 Fig.6 Radar map of soy sauce flavor at different sterilization temperatures under rapid cooling condition

灭菌后酱油与生酱油相比，其鲜味评分都有一定的提升，3#的鲜味评分最高，从肽分子量分布(见表3)来看，其<500 u短肽含量较高，有可能经过加热促使大分子肽断裂，较多的鲜味氨基酸呈现出来；咸味评分也有一定程度的提升，酱油整体上滋味以咸鲜味为主，鲜味和咸味相互影响，在提升鲜味的同时会给人感觉咸味有所提升，理论上也有可能是经过美拉德反应，消耗了少量的还原糖，整体上在咸味上也会有少量提升；香气、浓厚感及协调性的提升，从理论上主要是美拉德反应产物赋予其品质的提升，邓岳等研究表明杀菌工艺会使酱油的整体香味物质结构发生改变，使得各种香气物质之间的含量相对均匀，对酱油香气品质的最终形成具有重要作用。

3 结论

本文主要探讨了不同灭菌温度以及不同降温方式对酱油感官评价和理化指标的影响，结果表明3-3#酱油(即灭菌条件98 ℃、20 min，快速冷却至45 ℃保持24 h)的豉香浓郁，香气佳，并且口感上鲜味及浓厚感较优，在理化指标上显示该灭菌及降温方式使酱油的短肽(肽分子量<500 u)百分比较高(高达94.05%)，而氨基酸肽氮含量和还原糖含量与生酱油相比相差不明显，并且在37 ℃保温储藏过程中色率增加值较低，整体较稳定；相同降温方式、不同灭菌温度(90 ℃和98 ℃)下的酱油对比，98 ℃灭菌20 min在香气上稍优于90 ℃灭菌20 min；3种降温方式的酱油对比，自然降温方式(1#模式)酱油，结合风味和理化指标结果，同其他两种降温方式酱油相比，自然降温整体降温较慢，长时间处在高温状态下，美拉德反应较剧烈。

杀菌工艺对酱油品质的影响一直是研究热点，是酱油香味物质形成的关键步骤，本文研究发现冷却工艺同样对酱油品质的影响较为明显，为酱油生产工艺的改进提供了一定的理论基础和方法指导。