微生物菌种保藏方法及关键技术

郭玲玲

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁 朝阳 122000)

1 菌种保藏的重要性及其发展

菌种是国家的重要生物资源，也是生产、教学和科学研究的基本材料。近年来，越来越多的微生物菌种被研究并运用到食品、医药、农业等各个领域，菌种作为生产的源头，其质量好坏直接关系到产品的产量和品质[1]。在微生物领域，不管是基础科研工作还是生物技术的应用研究，都需要正确的菌种保藏方法和技术，以保证菌种的质量和活力。

为使自然界分离菌株原有的优质性能持久保存，最大程度地发挥作用，为人类服务，世界各国陆续开始重视微生物菌种的保藏工作。菌种保藏研究始于1890 年，1906年各国相继建立了菌种保藏机构。目前，世界上约有近600个菌种保藏机构。其中著名的有美国典型菌种保藏中心(ATCC)于1925年建立，是世界上规模最大、保存微生物种类和数量最多的机构，保存病毒、衣原体、细菌、放线菌、酵母菌、真菌、藻类、原生动物等约 29 000株，均为典型株。荷兰真菌菌种保藏中心(CBS)于1904年建立，保存酵母菌、丝状真菌约 8 400种、18 000株，大多是模式株﹔英国全国菌种保藏中心(NCTC)保存医用和兽医用病原微生物约2 740株﹔英联邦真菌研究所(CMI)保存真菌模式株8 000株﹔日本大阪发酵研究所保存普通微生物菌种和工业微生物菌种约9 000株[2]。中国的菌种保藏机构于 20 世纪50年代才开始建设，直到1979年成立了中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM，北京)，并正式成立6个专业性保藏管理中心[3]。随着科学技术的进步，人们逐渐认识到好的菌种保藏技术是获得优良菌种的保证，研究和选择一种适宜的保藏方法成为专家学者们重要的研究工作[4]。

2 菌种的常规保藏方法

常用菌种保藏方法优缺点见表1。

表1 常用菌种保藏方法优缺点比较

2.1 定期移植法

定期移植法是当前实验室使用最多的短期保藏菌种方法。实验室内通常放置于 4 ℃ 冰箱进行短期的菌种保藏。在培养和保存的过程中，由于代谢产物的累积而改变了原始菌种的生活条件，致使菌落群体中的个体不断衰老和死亡，因此每5～15 d或 1～4个月需要重新移植一次，具体间隔时间因种而异。凡能人工培养的微生物都可用此法保存[5]。

2.2 矿物油保藏法

矿物油保藏法是法国人Lumiere 于1914 年发明的，在世界范围内广泛采用[6]。该方法通过矿物油防止培养基因水分蒸发而干燥﹐隔绝斜面菌体与空气接触，降低微生物代谢活性，使其处于休眠状态，可以延长微生物的寿命，保持菌种优良的种性。可保藏3～5 a，是一种中长期的菌种保藏方法。

2.3 甘油法

甘油法是利用无菌生理盐水将菌种制备成菌悬液，再用灭菌的40%～50%甘油作为保护剂，不破坏菌种的原生质层和细胞膜，可保藏3～5 a[7]。

2.4 真空冷冻干燥保藏法

微生物在低温、干燥和缺氧的条件下，菌种的代谢活动相对静止。该方法结合了多种菌种保藏方法的特点，从而营造一个不宜菌种生长而又能长期保藏的环境。此法适用于病毒、衣原体、支原体、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等的长期保存，真空冷冻干燥保藏法是专业机构保藏菌种使用最多的方法。

2.5 干燥保藏法

干燥保藏法也叫载体保藏法，保藏期限可达2～5 a。根据载体不同，干燥保藏法主要有沙土管保藏法、滤纸保藏法、明胶片保藏法、硅胶保藏法、麸皮保藏法等。其中沙土管保藏法、滤纸保藏法、明胶片保藏法使用最多。

2.6 液氮超低温保藏法

液氮超低温保藏法的特点是微生物代谢降低到完全停止的状态，不需定期移植。常用的保护剂有甘油、血清蛋白、糊精、吐温-80等。液氮超低温保藏法是保藏菌种较理想的方法，变异的可能性较低，保存时间长达5～8 a。

3 菌种保藏目前存在的问题

我国在菌种保藏技术研究领域起步较晚，还没有形成系统性的操作规程，主要存在以下问题：对照试验次数有限，试验种类少，研究技术手段有待进一步更新，对于试验因子(如菌种的菌龄、接种菌丝块的大小、培养基类型、降温冷冻和升温复苏的速度、检测指标、防冻保护剂类型等)的控制研究不足。

目前常用的菌种保藏方法为液氮超低温保藏法、真空冷冻干燥保藏法、定期移植法、矿物油保藏法等。部分研究表明前两种方法保藏效果较好，适合菌种长期保藏。然而仍存在着问题，例如即便是同一物种的蛹虫草，不同研究人员使用相似的方法，得出的结论却不尽相同。同时，液氮超低温保藏法和真空冷冻干燥保藏法，需要良好的设备及技术，投入过高，不能广泛应用于生产；后两种方法虽然简单、廉价，但占据的保藏空间较大，且由于转管次数过多，变异的可能性增大，极易造成菌种退化，给生产带来损失。因此，探讨高效廉价、操作简单的菌种保藏方式非常必要，从而获得更加科学和实用的结果[8-12]。

4 菌种保藏技术研究

4.1 斜面培养基成分对菌种保存活性的影响

4.1.1 多种保藏培养基同时使用 由于低温状态菌种的代谢仍未停止，较低的碳氮比是保藏培养基设计关键。例如：使用钾细菌培养基和PDA培养基进行保存，前者保存钾细菌6个月时已经死亡，而后者保存8个月时活力仍然旺盛。

4.1.2 经常更换培养基配方 同一菌种长期使用同一培养基，菌丝的生长速度会减慢，这是因为菌丝一直生长在半合成的培养基上，与其自然环境不同，某些酶和活性物质长期得不到启用，会钝化或丧失活力。例如，金针菇更替使用综合麸皮培养基和黄豆芽培养基可减少节孢子产生。

4.2 有孔胶塞封口能适当延长保存期

试管斜面用棉塞封口，培养基易失水干缩；而用无孔胶塞封口，有些不耐低氧的菌种易死亡。在胶塞上钻孔，孔径1.5 mm，再用棉花封孔，来协调保水与通气的矛盾,可有效延长保存期。

4.3 石蜡油保藏法

石蜡油保藏法保存期限见表2。

表2 石蜡油保藏法保存期限

石蜡油保藏法不适宜保藏下列菌种：①真菌：布拉氏霉属(Blaskeslea)、毛壳霉属(Chaetomium)、卷霉属(Circinella)、笄霉属(Choanephora)；②细菌：固氮菌属(Azotobater)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leucoustoc)、分枝杆菌属(Mycobacter)、红螺菌属(Rhodospirillum)、沙门氏杆菌属(Salmonella) 等。

4.4 冷冻保藏法的改进

4.4.1 普通冰箱法 以普通冰箱的冷冻室代替液氮罐进行菌种的冷冻保藏，大大增加了冷冻保藏的实用性。本实验室利用普通冰箱法进行试验，将培养好的食用菌麦粒菌种分装到针剂瓶中，用灭过菌的双层报纸封口，放入大罐头瓶中，每个罐头瓶可放7～9个小瓶，再向罐头瓶内放生石灰，一直装到瓶口，最后用塑料薄膜将罐头瓶封口扎紧，新鲜石灰具有很强的吸湿性，可将麦粒菌种的含水量降到20%。同时，用麦粒菌种直接冷冻作为试验CK1；麦粒菌种加10%甘油作保护剂后冷冻作为CK2；斜面菌种加保护剂冷冻作为CK3，实验结果显示，CK1、 CK2和CK3的菌种成活率分别为41.5%、56.2%、75.3%，改进后的保藏方法菌种成活率为100%。

4.4.2 培养基中加入保护性物质 在培养基中加入保护性物质，使培养出的菌体对冷冻和冷冻干燥有较好的耐性。乳酸杆菌和其他的乳酸菌相比，在进行冷冻和冷冻干燥处理时存活力较低，在培养时，培养基加入50 μg/mL 亚油酸，其存活率可提高几十倍。

4.4.3 合成液体培养基 合适的培养基可以维持微生物在半休眠状态下的营养，矿物质及微量元素是微生物酶的激活剂。培养基中加入硫酸锌、硫酸铜、枸橼酸钠、盐酸吡咯醇等，-20 ℃冰冻保存，可使微生物保存10 a以上。

4.5 特殊基质保藏法

4.5.1 具有驯化功能的土壤保藏法 从土壤中筛选出来的胶质芽胞杆菌往往由于定殖能力不强，在土壤中难以维持基本的菌群数量，达不到应有的解钾效果。胶质芽胞杆菌经未灭菌的自然土壤驯化4个月后，在硅酸盐细菌分离培养基上培养3 d，菌落平均直径从7.17 mm增加到15.63 mm，其方差分析差异达到极显著水平。

4.5.2 具有驯化和筛选功能的液体保藏法 醋酸菌在斜面培养基上易退化，生产性能不稳定，选用合适的液体培养基，如在常规培养基中加入8%～10%乙酸、3%～5%乙醇，然后按10%接种，密封，30 ℃静止培养8～12 h，放入冰箱保存。结果表明既可保藏菌种，又具有驯化和筛选功能。

4.6 真空冷冻干燥保藏法

4.6.1 保护剂的改进 在分散剂中添加低分子物质，可使冷冻干燥后的样品含水量不至于过低，起到缓冲作用(见表3)。

表3 用于真空冷冻干燥保藏法的保护剂

4.6.2 极端嗜盐菌保存 极端嗜盐菌必须在20%～25% NaCl存在下才能很好生长，而且需要一定浓度NaCl维持完整的细胞膜结构。以5% NaCl溶液配成6%海藻糖代替10%脱脂牛奶作冷冻干燥的保护剂，可提高存活率。

5 展 望

菌种质量的高低直接影响着后期代谢功能的强弱[13]，优质菌种在相关产业中起着决定性作用，是其能否正常运行的物质基础[14]。菌种保藏是优质菌种研究的核心，是种质资源研究的重要方面，是菌种质量的前提和保证。建立经济有效的菌种保藏方法，不仅可以有效保存菌种的优良性状，保持其活力与产量，而且对于种质资源的保存与后续研究都有极其重要的作用[15-18]。

目前菌种保藏的研究基础还比较薄弱, 还需要行业内的科研人员继续努力，从方便生产的角度出发，本着简便、高效、廉价等目标，结合多学科知识，在常规菌种保藏方法的基础上，不断进行改进优化，以期获得可推广应用的菌种保藏技术。